Wnt/β-catenin信號通路在進化中高度保守。在胚胎發(fā)育過程中,其在細胞分化、增殖、遷移等過程中發(fā)揮著關鍵作用。在成體組織中,其對成體干細胞自我更新能力的維持、組織的損傷修復發(fā)揮著重要的作用。Wnt信號的失調不但對腫瘤的發(fā)生至關重要,而且對晚期腫瘤的轉移形成起到了關鍵作用。因此,Wnt信號通路是非常具有吸引力的抗腫瘤藥物靶點。本課題的主要研究目標是系統(tǒng)性尋找參與Wnt信號通路的重要調控分子。本課題結合Wnt/β-catenin信號通路報告細胞系和CRISPR/Cas全基因組篩選技術,通過兩輪篩選及生物信息學分析,尋找參與Wnt信號通路下游調控的信號分子。為了進一步驗證篩選結果,選取多個篩選基因,并將其逐個在報告細胞中敲除。在基因敲除后的報告細胞內,通過RT-QPCR技術檢測Wnt下游基因Axin2 mRNA的表達,通過WB技術檢測β-catenin蛋白的表達,進而驗證篩選得到的基因是否對Wnt信號通路的調控起到關鍵作用。第一輪篩選富集了460個基因,其中已知的Wnt信號分子占3.5%,第二輪富集了29個基因,已知的Wnt信號分子占20.7%。表明我們第二輪篩選更有效的富集了與Wn... 

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 WNT/β-CATENIN信號通路
        1.1.1 Wnt信號通路的類型
        1.1.2 經典Wnt信號通路
    1.2 WNT/β-CATENIN信號通路與疾病
    1.3 CRISPR / CAS系統(tǒng)
    1.4 基因篩選策略
    1.5 本課題的主要研究內容
第2章 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 抗體
        2.1.3 試劑與儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng),傳代和凍存
        2.2.2 細胞瞬時轉染
        2.2.3 慢病毒包裝和轉染
        2.2.4 擴增全基因組敲除的g RNA文庫
        2.2.5 質粒提取實驗步驟
        2.2.6 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測細胞活力
        2.2.7 流式細胞術分選與分析
        2.2.8 苯酚/氯仿方法提取細胞基因組DNA
        2.2.9 聚合酶鏈式反應擴增目的片段
        2.2.10 磁珠純化DNA片段
        2.2.11 二代測序及生物信息學分析
        2.2.12 構建表達g RNA和cas9的質粒
        2.2.13 Trizol法提取的細胞總的RNA
        2.2.14 RT-QPCR測基因表達
        2.2.15 蛋白質印跡法測蛋白水平的表達(Western Blot)
第3章 結果
    3.1 建立CRISPR/CAS篩選所需的細胞系
        3.1.1 建立Wnt/β-catenin信號通路報告細胞系
        3.1.2 建立穩(wěn)定表達Cas9的報告細胞系
    3.2 CRISPR/CAS基因篩選系統(tǒng)的建立
        3.2.1 人類全基因組g RNA文庫的分布
        3.2.2 慢病毒g RNA文庫包裝和感染
        3.2.3 流式分析基因敲除后細胞的GFP熒光強度的變化
        3.2.4 g RNA的建庫以及質量控制
        3.2.5 生信分析原始g RNA文庫與Baseline的差異
    3.3 第一輪篩選
    3.4 對富集的GRNA進行第二輪篩選
    3.5 兩輪篩選的比較
    3.6 驗證CRISPR/CAS篩選得到的信號分子
        3.6.1 第一次驗證候選基因
        3.6.2 在給 CHIR 3um 的情況下再次驗證候選基因
        3.6.3 檢測候選基因敲除對Axin2表達的影響
        3.6.4 候選基因與疾病的關系
    3.7 討論
結論
參考文獻
致謝



本文編號：3701928