革蘭氏陰性菌在水產(chǎn)動(dòng)物病原菌中種類(lèi)最多,是水產(chǎn)動(dòng)物主要致病性病原菌。N-�；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）,是革蘭氏陰性菌致病性應(yīng)答系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子。當(dāng)菌群中AHLs累計(jì)到一定濃度后,能激活病原菌致病基因的表達(dá),導(dǎo)致病害的發(fā)生。N-�；呓z氨酸內(nèi)酯酶是一類(lèi)特異性降解AHLs的金屬蛋白水解酶,存在廣泛,在多種微生物中均有發(fā)現(xiàn)。近年來(lái),N-�；呓z氨酸內(nèi)酯酶作為群體感應(yīng)淬滅策略的工具酶成為研究的熱點(diǎn)。本研究的目的是通過(guò)對(duì)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis T-1）中的N-酰胺內(nèi)酯酶基因ytn P進(jìn)行克隆表達(dá),研究其作用與功能,從群體感應(yīng)抑制角度,探索水產(chǎn)細(xì)菌性病害的新的路徑,為水產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障。1.ytn P基因的全長(zhǎng)克隆及生物學(xué)分析本研究自地衣芽孢桿菌T-1全基因組測(cè)序得到y(tǒng)tn P基因的全長(zhǎng)序列,通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因ytn P,連接克隆載體pGEM-T Easy Vector,篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)一步測(cè)序鑒定,得到y(tǒng)tnP的全長(zhǎng)900 bp序列;通過(guò)對(duì)ytn P的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ytn P編... 

【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.1.1 革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR系統(tǒng)
        1.1.2 革蘭氏陽(yáng)性菌的雙組分群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.1.3 LuxS/AI-2依賴(lài)的群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.1.4 其他的QS系統(tǒng)
        1.1.5 群體感應(yīng)與病原菌致病性
    1.2 嗜水氣單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.2.1 嗜水氣單胞菌簡(jiǎn)介
        1.2.2 嗜水氣單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.2.3 嗜水氣單胞菌的毒力因子
        1.2.4 嗜水氣單胞菌的生物被膜
    1.3 群體感應(yīng)淬滅酶
        1.3.1 群體感應(yīng)淬滅
        1.3.2 AHL內(nèi)酯酶
        1.3.3 AHLs�；�
        1.3.4 AHLs氧化還原酶
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)T-1的ytnP基因全長(zhǎng)的克隆及分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與工具酶
        2.1.3 緩沖液和培養(yǎng)基
        2.1.4 引物合成
        2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 地衣芽孢桿菌T-1基因組的提取
        2.2.2 ytnP擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)
        2.2.3 ytnP的全長(zhǎng)克隆
        2.2.4 ytnP序列的生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 地衣芽孢桿菌T-1基因組提取
        2.3.2 地衣芽孢桿菌T-1ytnP基因的全長(zhǎng)克隆
        2.3.3 ytnP序列的生物信息學(xué)分析
    2.4 討論
第三章 ytnP的原核表達(dá),純化與酶活測(cè)定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 溶液配置
        3.1.4 引物合成
        3.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 大腸桿菌表達(dá)載體pEASY-BluntE1-ytnP的構(gòu)建
        3.2.2 ytnP在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測(cè)
        3.2.3 重組酶YtnP的純化
        3.2.4 重組酶YtnP的透析復(fù)性
        3.2.5 BCA蛋白定量測(cè)定蛋白濃度
        3.2.6 YtnP活性測(cè)定
        3.2.7 Ytnp的酶活測(cè)定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 高保真酶克隆ytnP
        3.3.2 重組酶YtnP在大腸桿菌中的表達(dá)鑒定
        3.3.3 YtnP的純化
        3.3.4 YtnP的透析復(fù)性
        3.3.5 BCA測(cè)定蛋白濃度
        3.3.6 YtnP酶活測(cè)定
    3.4 討論
第四章 YtnP對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基
        4.1.4 儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 YtnP的制備
        4.2.2 嗜水氣單胞菌初始濃度對(duì)生物膜形成的影響
        4.2.3 YtnP對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制作用
        4.2.4 4種抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌最小抑菌濃度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)的測(cè)定
        4.2.5 YtnP和抗生素協(xié)同作用對(duì)嗜水氣單胞菌MIC的影響
        4.2.6 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 不同濃度的嗜水氣單胞菌對(duì)其生物膜形成的影響
        4.3.2 YtnP對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制作用
        4.3.3 4種抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC測(cè)定結(jié)果
        4.3.4 YtnP與抗生素的協(xié)同作用對(duì)嗜水氣單胞菌MIC的影響
    4.4 討論
第五章 YtnP對(duì)嗜水氣單胞菌毒力因子表達(dá)調(diào)控研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和實(shí)驗(yàn)用魚(yú)
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 溶液
        5.1.4 主要儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線繪制
        5.2.2 細(xì)菌RNA的提取
        5.2.3 細(xì)菌RNA質(zhì)量的檢測(cè)
        5.2.4 細(xì)菌RNA的反轉(zhuǎn)錄
        5.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)毒力基因表達(dá)
        5.2.6 溶血活性測(cè)定
        5.2.7 YtnP對(duì)異育銀鯽(C.auratusgibelio)的保護(hù)實(shí)驗(yàn)
        5.2.8 數(shù)據(jù)分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線
        5.3.2 熒光定量引物驗(yàn)證
        5.3.3 添加YtnP對(duì)嗜水氣單胞菌毒力基因表達(dá)量的影響
        5.3.4 溶血活性測(cè)定
        5.3.5 重組酶YtnP對(duì)異育銀鯽的保護(hù)實(shí)驗(yàn)
    5.4 討論
全文總結(jié)
展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]阿魏植物精油對(duì)紫色桿菌群體感應(yīng)的影響[J]. 王錦利,周愛(ài)蓮,林其洋,劉明鑫,白偉娟,李梅娟,方婷.  現(xiàn)代食品科技. 2016(10)
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碩士論文
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[2]外源信號(hào)分子AI-2對(duì)嗜水氣單胞菌生物被膜的特性研究[D]. 楊安林.廣東工業(yè)大學(xué) 2015
[3]氣單胞菌的毒力基因檢測(cè)及環(huán)境因子對(duì)毒力基因表達(dá)的影響[D]. 范騰飛.合肥工業(yè)大學(xué) 2013
[4]N-�；呓z氨酸內(nèi)酯酶的原核表達(dá)、純化及酶學(xué)特性研究[D]. 張峰.福建師范大學(xué) 2009
[5]aiiA基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其活性檢測(cè)[D]. 溫曉芳.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3695100