革蘭氏陰性菌在水產(chǎn)動物病原菌中種類最多,是水產(chǎn)動物主要致病性病原菌。N-�；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）,是革蘭氏陰性菌致病性應答系統(tǒng)中的關鍵信號分子。當菌群中AHLs累計到一定濃度后,能激活病原菌致病基因的表達,導致病害的發(fā)生。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶是一類特異性降解AHLs的金屬蛋白水解酶,存在廣泛,在多種微生物中均有發(fā)現(xiàn)。近年來,N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶作為群體感應淬滅策略的工具酶成為研究的熱點。本研究的目的是通過對地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis T-1）中的N-酰胺內(nèi)酯酶基因ytn P進行克隆表達,研究其作用與功能,從群體感應抑制角度,探索水產(chǎn)細菌性病害的新的路徑,為水產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供技術保障。1.ytn P基因的全長克隆及生物學分析本研究自地衣芽孢桿菌T-1全基因組測序得到y(tǒng)tn P基因的全長序列,通過PCR擴增目的基因ytn P,連接克隆載體pGEM-T Easy Vector,篩選陽性克隆并進一步測序鑒定,得到y(tǒng)tnP的全長900 bp序列;通過對ytn P的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),ytn P編... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 細菌的群體感應系統(tǒng)
        1.1.1 革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR系統(tǒng)
        1.1.2 革蘭氏陽性菌的雙組分群體感應系統(tǒng)
        1.1.3 LuxS/AI-2依賴的群體感應系統(tǒng)
        1.1.4 其他的QS系統(tǒng)
        1.1.5 群體感應與病原菌致病性
    1.2 嗜水氣單胞菌的群體感應系統(tǒng)
        1.2.1 嗜水氣單胞菌簡介
        1.2.2 嗜水氣單胞菌的群體感應系統(tǒng)
        1.2.3 嗜水氣單胞菌的毒力因子
        1.2.4 嗜水氣單胞菌的生物被膜
    1.3 群體感應淬滅酶
        1.3.1 群體感應淬滅
        1.3.2 AHL內(nèi)酯酶
        1.3.3 AHLs�；�
        1.3.4 AHLs氧化還原酶
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)T-1的ytnP基因全長的克隆及分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與工具酶
        2.1.3 緩沖液和培養(yǎng)基
        2.1.4 引物合成
        2.1.5 主要實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 地衣芽孢桿菌T-1基因組的提取
        2.2.2 ytnP擴增引物的設計
        2.2.3 ytnP的全長克隆
        2.2.4 ytnP序列的生物信息學分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 地衣芽孢桿菌T-1基因組提取
        2.3.2 地衣芽孢桿菌T-1ytnP基因的全長克隆
        2.3.3 ytnP序列的生物信息學分析
    2.4 討論
第三章 ytnP的原核表達,純化與酶活測定
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 溶液配置
        3.1.4 引物合成
        3.1.5 主要實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 大腸桿菌表達載體pEASY-BluntE1-ytnP的構建
        3.2.2 ytnP在大腸桿菌中的表達與檢測
        3.2.3 重組酶YtnP的純化
        3.2.4 重組酶YtnP的透析復性
        3.2.5 BCA蛋白定量測定蛋白濃度
        3.2.6 YtnP活性測定
        3.2.7 Ytnp的酶活測定
    3.3 結果與分析
        3.3.1 高保真酶克隆ytnP
        3.3.2 重組酶YtnP在大腸桿菌中的表達鑒定
        3.3.3 YtnP的純化
        3.3.4 YtnP的透析復性
        3.3.5 BCA測定蛋白濃度
        3.3.6 YtnP酶活測定
    3.4 討論
第四章 YtnP對嗜水氣單胞菌生物膜的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基
        4.1.4 儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 YtnP的制備
        4.2.2 嗜水氣單胞菌初始濃度對生物膜形成的影響
        4.2.3 YtnP對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制作用
        4.2.4 4種抗生素對嗜水氣單胞菌最小抑菌濃度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)的測定
        4.2.5 YtnP和抗生素協(xié)同作用對嗜水氣單胞菌MIC的影響
        4.2.6 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結果與分析
        4.3.1 不同濃度的嗜水氣單胞菌對其生物膜形成的影響
        4.3.2 YtnP對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制作用
        4.3.3 4種抗生素對嗜水氣單胞菌的MIC測定結果
        4.3.4 YtnP與抗生素的協(xié)同作用對嗜水氣單胞菌MIC的影響
    4.4 討論
第五章 YtnP對嗜水氣單胞菌毒力因子表達調(diào)控研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗菌株和實驗用魚
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 溶液
        5.1.4 主要儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細菌生長曲線繪制
        5.2.2 細菌RNA的提取
        5.2.3 細菌RNA質(zhì)量的檢測
        5.2.4 細菌RNA的反轉錄
        5.2.5 熒光定量PCR檢測毒力基因表達
        5.2.6 溶血活性測定
        5.2.7 YtnP對異育銀鯽(C.auratusgibelio)的保護實驗
        5.2.8 數(shù)據(jù)分析
    5.3 結果與分析
        5.3.1 嗜水氣單胞菌生長曲線
        5.3.2 熒光定量引物驗證
        5.3.3 添加YtnP對嗜水氣單胞菌毒力基因表達量的影響
        5.3.4 溶血活性測定
        5.3.5 重組酶YtnP對異育銀鯽的保護實驗
    5.4 討論
全文總結
展望
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3695100