維生素B₆包含六種可以相互轉(zhuǎn)換的吡啶類化合物,它們分別是:吡哆醇（P-ridoxine,PN）,吡哆醛（Pyridoxal,PL）,吡哆胺（Pyridoxamin,PM）;以及對應(yīng)的磷酸酯形式:磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate,PNP）,磷酸吡哆醛（P yridoxal-5’-phosphate,PLP）和磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP）。其中PLP是VB₆的活性形式,是140多種酶的輔酶,涉及氨基酸的多種反應(yīng),在許多物質(zhì)的合成、代謝轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用。PLP在維持機體生化穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用,包括:生物體內(nèi)氨基酸的代謝以及它自身化學結(jié)構(gòu)的特點,活潑的醛基使它極易與含有氨基的化合物結(jié)合,生成醛亞胺類物質(zhì)對生命體的正常活動產(chǎn)生影響。因此必須將VB₆中的其他形式轉(zhuǎn)化為PLP。通常參與代謝的酶有ATP依賴性PL激酶和FMN依賴性PNP氧化酶。而PLP的水解是控制細胞內(nèi)游離PLP水平的一個重要機制,因此可催化PLP水解的磷酸酶對維持生物體內(nèi)PLP濃度在一個正... 

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 維生素B_6簡介及其在生物體內(nèi)的作用
    1.2 維生素B_6的生物合成
    1.3 生物體內(nèi)維生素B_6的代謝轉(zhuǎn)換
    1.4 磷酸酶論述
        1.4.1 磷酸酶簡介
        1.4.2 PLP磷酸酶研究進展
    1.5 RNAi簡介
2 引言
    2.1 研究背景與意義
    2.2 研究內(nèi)容
3 材料與方法
    3.1 材料、實驗設(shè)備及主要試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要實驗設(shè)備
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 常用試劑配制(見表3-1)
    3.2 實驗方法
        3.2.1 序列分析
        3.2.2 煙草磷酸吡哆醛磷酸酶基因克隆
        3.2.3 構(gòu)建原核表達載體
        3.2.4 重組蛋白的表達與分析
        3.2.5 NtPLPP酶活的測定
        3.2.6 NtPLPPRNAi載體的構(gòu)建
        3.2.7 農(nóng)桿菌侵染煙草葉片
        3.2.8 熒光定量檢測
        3.2.9 煙草NtPLPP基因的亞細胞定位
4 實驗結(jié)果與分析
    4.1 煙草NtPLPP cDNA序列分析
    4.2 煙草NtPLPP基因的克隆
        4.2.1 煙草NtPLPP cDNA的獲得
        4.2.2 煙草NtPLPP基因的克隆
    4.3 煙草NtPLPP的原核表達
        4.3.1 煙草NtPLPP原核表達載體的構(gòu)建
        4.3.2 NtPLPP的目的蛋白誘導
    4.4 蛋白濃度的測定
    4.5 NtPLPP的部分酶學性質(zhì)分析
        4.5.1 最適pH值
        4.5.2 酶促反應(yīng)的最適溫度
        4.5.3 酶促反應(yīng)時間
        4.5.4 對不同底物的催化活性比較
    4.6 RNAi載體的構(gòu)建
        4.6.1 沉默片段的PCR擴增
        4.6.2 反向干擾片段載體構(gòu)建
        4.6.3 正向干擾片段載體構(gòu)建
        4.6.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性檢測
        4.6.5 煙草NtPLPP的RNAi瞬時沉默效率檢測
        4.6.6 煙草NtPLPP瞬時沉默后VB_6代謝其他相關(guān)基因的變化
    4.7 煙草NtPLPP基因亞細胞定位的分析
5 討論
    5.1 NtPLPP的氨基酸序列分析
    5.2 煙草磷酸吡哆醛磷酸酶的最適反應(yīng)條件
    5.3 底物特異性分析
    5.4 NtPLPP基因RNAi效果
    5.5 NtPLPP對其它VB_6代謝相關(guān)酶基因表達的影響
    5.6 NtPLPP基因的亞細胞定位分析
6 結(jié)論
    6.1 NtPLPP基因的克隆、序列分析
    6.2 酶學性質(zhì)分析
    6.3 NtPLPPRNAi載體沉默效果以及對代謝相關(guān)基因的影響
    6.4 亞細胞定位分析
參考文獻
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]響應(yīng)低磷的大豆蛋白磷酸酶GmHAD1亞家族生化和功能分析[D]. 莫小惠.華南農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]煙草磷酸吡哆醛水解酶的分離純化與表征[D]. 馬婭萍.安徽農(nóng)業(yè)大學 2012
[3]擬南芥VSP1蛋白酸性磷酸酶活性及初步晶體學研究[D]. 史竹兵.安徽大學 2010



本文編號：3687769