CRISPR/Cas9作為一種新興的基因編輯工具已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于體內(nèi)和體外的基因編輯,包括致病基因的糾正、功能基因的驗(yàn)證等。然而由于CRISPR/Cas9的大尺寸,如何安全有效的實(shí)現(xiàn)體內(nèi)遞送仍然是限制其進(jìn)一步發(fā)展為人類體內(nèi)應(yīng)用的障礙。病毒載體往往受限于其免疫原性和包裝能力,非病毒載體由于其靈活性得到越來(lái)越多的關(guān)注,但是也受到較低的轉(zhuǎn)染效率和較高毒性的制約。雖然多種CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送載體實(shí)現(xiàn)在腫瘤疾病中的應(yīng)用,但是在心血管疾病中的應(yīng)用微乎其微。普魯蘭糖或者膽固醇功能化的PGEA載體在基因遞送方面顯示出巨大的潛力。針對(duì)以上問(wèn)題,本論文基于PGEA的基因載體實(shí)現(xiàn)有效的CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送用于心血管疾病領(lǐng)域。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9（Pcsk9）主要表達(dá)在肝臟和小腸組織,是治療和預(yù)防冠心病的重要靶點(diǎn)。目前臨床上已經(jīng)有Pcsk9的單克隆抗體用于冠心病的治療,但是價(jià)格昂貴,需要重復(fù)給藥。通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)Pcsk9的基因編輯同時(shí)降低全身給藥的副作用將為冠心病的治療提供一種策略�；诖宋覀儤�(gòu)建了普魯蘭修飾的PGEA（Pul-PGEA）作為C... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
第一章 緒論
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)介
        1.1.1 CRISPR/Cas9概況
        1.1.2 CRISPR/Cas9作用原理
        1.1.3 CRISPR/Cas9的應(yīng)用現(xiàn)狀
            1.1.3.1 構(gòu)建疾病動(dòng)物模型
            1.1.3.2 糾正致病基因
            1.1.3.3 治療病毒性疾病
    1.2 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療效果的因素
        1.2.1 sgRNA的特異性
        1.2.2 編碼方式
        1.2.3 編輯效率
        1.2.4 編輯細(xì)胞的適應(yīng)性
    1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的體內(nèi)遞送方式
        1.3.1 病毒載體
        1.3.2 流體動(dòng)力學(xué)注射
        1.3.3 化學(xué)載體
    1.4 常見(jiàn)的非病毒基因載體
        1.4.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體
        1.4.2 聚合物載體
    1.5 本課題的意義
第二章 普魯蘭糖修飾的PGEA構(gòu)建高效基因載體遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)在心臟疾病中的應(yīng)用研究
    2.1 基于普魯蘭的納米系統(tǒng)介導(dǎo)CRISPR/Cas9有效遞送用于體內(nèi)基因編輯
        2.1.1 前言
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)部分
            2.1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.2.3 靶向Pcsk9基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
            2.1.2.4 靶向Pcsk9基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的篩選
            2.1.2.5 材料Pul-PGEA的合成
            2.1.2.6 材料Pul-PGEA的表征
            2.1.2.7 納米顆粒理化性質(zhì)的表征
            2.1.2.8 生物安全性分析
            2.1.2.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分析
            2.1.2.10 體外基因編輯潛力分析
            2.1.2.12 體內(nèi)遞送效率分析
            2.1.2.13 體內(nèi)基因編輯分析
            2.1.2.14 體內(nèi)材料的安全性分析
        2.1.3 結(jié)果與討論
            2.1.3.1 靶向Pcsk9的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與篩選
            2.1.3.2 納米顆粒理化性質(zhì)表征
            2.1.3.3 材料Pul-PGEA體外生物安全性
            2.1.3.4 材料Pul-PGEA的轉(zhuǎn)染能力分析
            2.1.3.5 材料Pul-PGEA體外介導(dǎo)基因編輯
            2.1.3.6 材料Pul-PGEA體內(nèi)遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)效率
            2.1.3.7 體內(nèi)基因編輯所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)
            2.1.3.8 材料Pul-PGEA的體內(nèi)安全性
        2.1.4 本章小結(jié)
    2.2 通過(guò)Pul-PGEA共遞送Cas9 mRNA和sgRNA實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肝靶向基因編輯
        2.2.1 前言
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)部分
            2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
            2.2.2.3 靶向Apoc3的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與篩選
            2.2.2.4 體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA和sgRNA
            2.2.2.5 納米顆粒的表征
            2.2.2.6 細(xì)胞毒性分析
            2.2.2.7 材料Pul-PGEA介導(dǎo)小RNA遞送分析
            2.2.2.8 材料Pul-PGEA遞送長(zhǎng)鏈Cas9 mRNA潛力分析
        2.2.3 結(jié)果與討論
            2.2.3.1 靶向Apoc3的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建
            2.2.3.2 納米顆粒的理化性質(zhì)表征
            2.2.3.3 納米顆粒的細(xì)胞毒性
            2.2.3.4 基因載體Pul-PGEA介導(dǎo)小RNA的細(xì)胞吞噬
            2.2.3.5 基因載體Pul-PGEA介導(dǎo)長(zhǎng)鏈Cas9 mRNA遞送分析
        2.2.4 本章小結(jié)
第三章 富含羥基的納米系統(tǒng)遞送CRISPR/Cas9用于主動(dòng)脈上的基因編輯
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 基因Fbn1特異性CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建與篩選
        3.2.4 理化性質(zhì)表征
        3.2.5 生物安全性分析
        3.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析
        3.2.7 細(xì)胞吞噬分析
        3.2.8 內(nèi)涵體定位分析
        3.2.9 材料CHO-PGEA介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)分析
        3.2.10 材料CHO-PGEA體外介導(dǎo)CRISPR/Cas9基因編輯所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)
        3.2.11 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 基因Fbn1特異性CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建與篩選
        3.3.2 納米顆粒理化性質(zhì)表征
        3.3.3 生物安全性評(píng)價(jià)
        3.3.4 材料CHO-PGEA體外遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛力分析
        3.3.5 材料CHO-PGEA體外介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯分析
        3.3.6 材料CHO-PGEA體內(nèi)介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯分析
        3.3.7 材料CHO-PGEA體內(nèi)安全性分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
碩士研究生學(xué)位論文答辯委員會(huì)決議書(shū)



本文編號(hào)：3668929