作為世界上最重要的糧食作物之一,水稻生產(chǎn)關系到我國乃至世界的糧食安全。隨著人口增長、全球氣候變暖、耕地面積和水資源減少,我國水稻生產(chǎn)面臨著巨大挑戰(zhàn)。以CRISPR/Cas系統(tǒng)為代表的基因編輯技術可對靶標基因進行定點敲除、插入、替換等。大多數(shù)農(nóng)作物優(yōu)異等位基因差異主要是少數(shù)幾個堿基或小片段插入/缺失引起,通過基因編輯介導的同源重組技術,可快速實現(xiàn)優(yōu)異等位基因精準替換,大大縮短育種周期。但由于同源重組發(fā)生概率極低,特別是植物細胞含有細胞壁,無法將足量的修復模板遞送到細胞中,CRISPR/Cas介導的等位基因替換效率偏低,成功報道較少,已成為利用基因編輯進行農(nóng)作物等位基因替換的技術瓶頸和該領域的研究熱點及競爭焦點。CRISPR/Cas12a（Cpf1）屬于II類type V CRISPR系統(tǒng),具有組裝簡單、脫靶效率低等優(yōu)點,但識別的5’-TTTV-3’PAM限制了CRISPR/Cas12a的應用范圍。此外,CRISPR/Cas12a產(chǎn)生的交錯切割可能會促進同源重組的發(fā)生,但在植物中尚未有利用CRISPR/Cas12a進行等位基因替換的報道。本論文從以下幾方面進行了研究,并取得如下進展:1)構... 

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)類型
        1.1.1 DNA靶向的CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.1.2 RNA靶向的CRISPR/Cas系統(tǒng)
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因編輯和修復
        1.2.1 基因敲除
        1.2.2 單堿基編輯
        1.2.3 基因替換和定點整合
        1.2.4 基因表達調控
    1.3 CRISPR/Cas12a的作用機制研究進展
    1.4 植物基因編輯介導的基因同源重組研究概述
        1.4.1 植物基因同源重組研究進展
        1.4.2 植物基因同源重組存在問題
        1.4.3 植物基因同源重組研究與應用展望
    1.5 本論文研究內(nèi)容、技術路線及研究目的和意義
        1.5.1 研究內(nèi)容
        1.5.2 技術路線
        1.5.3 研究的目的和意義
第二章 Cas12a突變體擴展CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在水稻中的應用范圍
    2.1 引言
    2.2 實驗材料和方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗方法
    2.3 實驗結果
        2.3.1 敲除載體的構建
        2.3.2 對T_0代再生植株的基因型鑒定
        2.3.3 水稻基因組的生物信息學分析
        2.3.4 脫靶分析
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 CRISPR/Cas12a系統(tǒng)介導的以DNA為修復模板的水稻基因定點替換
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
    3.3 實驗結果
        3.3.1 同源重組載體的構建
        3.3.2 同源重組載體活性檢測
        3.3.3 T_0代再生植株的基因型鑒定
        3.3.4 脫靶分析
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 CRISPR/Cas12a系統(tǒng)介導的以RNA為修復模板的水稻基因片段定點替換
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗方法
    4.3 實驗結果
        4.3.1 同源重組載體的構建
        4.3.2 水稻愈傷中以RNA轉錄本為修復模板的基因片段替換
        4.3.3 利用ddPCR檢測不同實驗處理的同源重組效率
        4.3.4 T_0代再生植株的精準編輯基因型鑒定
        4.3.5 脫靶分析
        4.3.6 T_1代編輯植株孟德爾遺傳分析
        4.3.7 編輯植株表型鑒定
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 結論與展望
    5.1 全文結論
    5.2 展望
參考文獻
附錄A
附錄B
致謝
作者簡歷



本文編號：3668820