睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig Cell,LC）是雄性個體雄激素的主要來源,雄激素對男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育及男性生殖功能的維持具有決定性作用。DNA甲基化是核酸表觀遺傳修飾的主要表現(xiàn)方式之一,能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。到目前為止,尚未有研究在表觀遺傳方面對LC雄激素合成通路關(guān)鍵酶的表達(dá)及對雄激素分泌調(diào)控方面進(jìn)行報(bào)道。本研究首先分離不同發(fā)育階段的睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞（PLC）、睪丸間質(zhì)未成熟細(xì)胞（ILC）以及睪丸間質(zhì)成熟細(xì)胞（ALC）,同時以大鼠尾部成纖維細(xì)胞（TTF）作為對照,利用轉(zhuǎn)錄組測序RNA-seq技術(shù)和基因組甲基化測序RRBS技術(shù)相結(jié)合的方法,分析不同發(fā)育階段LC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化和基因組DNA甲基化圖譜差異,探索在LC發(fā)育過程中基因組DNA甲基化對雄激素合成通路關(guān)鍵酶基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,為了解LC譜系發(fā)育過程、雄激素合成調(diào)控機(jī)制及日后利用成體細(xì)胞重編程為具有功能的類睪丸間質(zhì)細(xì)胞提供科學(xué)依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下:1、對不同發(fā)育階段的LC（PLC、ILC、ALC）及TTF 8個樣本（2個重復(fù)）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,最終平均各樣本獲得6.60Gb數(shù)據(jù)。共檢測出15852個基因在LC中... 

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能及發(fā)育分化
        1.1.1 LC分類和功能
        1.1.2 LC類固醇生成途徑
        1.1.3 LC的分化調(diào)控和類固醇生成調(diào)節(jié)
    1.2 成纖維細(xì)胞研究簡介
    1.3 DNA甲基化研究簡介
        1.3.1 DNA甲基化調(diào)控機(jī)制及作用
        1.3.2 DNA甲基化檢測方法
    1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究簡介
    1.5 研究內(nèi)容、目的及意義
第二章 PLC、ILC、ALC及 TTF的轉(zhuǎn)錄組分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)用具與耗材
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.5 溶液配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分離
        2.2.2 雄性SD大鼠TTF分離
        2.2.3 總RNA提取
        2.2.4 總RNA質(zhì)量檢測
        2.2.5 RNA-seq文庫構(gòu)建
        2.2.6 RNA-seq文庫質(zhì)檢與上機(jī)測序
    2.3 生物信息學(xué)分析方法
        2.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析
        2.3.2 差異表達(dá)基因分析
        2.3.3 差異表達(dá)基因GO功能注釋和富集分析
        2.3.4 差異表達(dá)基因KEGG pathway富集分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 總RNA質(zhì)量檢測
        2.4.2 RNA-seq堿基質(zhì)量值
        2.4.3 RNA-seq堿基含量分布
        2.4.4 RNA-seq數(shù)據(jù)隨機(jī)性檢驗(yàn)
        2.4.5 RNA-seq數(shù)據(jù)飽和度檢驗(yàn)
        2.4.6 Unique mapped reads在參考基因組上的分布
        2.4.7 RNA-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出及與參考基因組比對分析
        2.4.8 不同發(fā)育階段LC(PLC、ILC、ALC)差異表達(dá)基因的分析
        2.4.9 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達(dá)基因分析
        2.4.10 LC各發(fā)育階段(PLC、ILC、ALC)差異表達(dá)基因GO和 KEGG pathway富集分析
        2.4.11 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達(dá)基因GO和 KEGG Pathway富集分析
第三章 PLC、ILC、ALC及 TTF的簡化甲基化圖譜分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)耗材
        3.1.4 主要試劑
        3.1.6 溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分離
        3.2.2 雄性SD大鼠TTF分離
        3.2.3 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測
        3.2.4 RRBS文庫構(gòu)建
        3.2.5 RRBS文庫質(zhì)檢與上機(jī)測序
    3.3 生物信息學(xué)分析方法
        3.3.1 RRBS數(shù)據(jù)質(zhì)控分析
        3.3.2 RRBS數(shù)據(jù)與參考基因組比對分析
        3.3.3 甲基化位點(diǎn)檢測
        3.3.4 區(qū)域甲基化水平分析
        3.3.5 差異甲基化區(qū)域(DMR)鑒定與分析
        3.3.6 差異甲基化基因(DCG)分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 基因組DNA質(zhì)量檢測
        3.4.2 RRBS堿基質(zhì)量分布
        3.4.3 RRBS堿基類型分布
        3.4.4 RRBS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
        3.4.5 RRBS測序深度分布統(tǒng)計(jì)
        3.4.6 CG、CHG及 CHH不同類型的甲基化位點(diǎn)分析
        3.4.7 基因不同功能元件甲基化水平
        3.4.8 DMR數(shù)目分析
        3.4.9 DMR在基因不同功能元件上的分布情況
        3.4.10 DMR在不同染色體上的分布情況
        3.4.11 差異甲基化基因(DCG)鑒定
第四章 PLC、ILC、ALC及 TTF全基因組甲基化與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.1 DMR-mRNA相關(guān)性分析
        4.1.2 差異甲基化且差異表達(dá)基因GO和 KEGG pathway富集分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 LC各發(fā)育階段甲基化組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
        4.2.2 LC與 TTF甲基化組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
第五章 討論
    5.1 PLC、ILC、ALC的差異表達(dá)候選基因分析
    5.2 PLC、ILC、ALC與 TTF的差異表達(dá)候選基因分析
    5.3 DNA甲基化介導(dǎo)的差異表達(dá)候選基因分析
    5.4 Promoter區(qū)域甲基化介導(dǎo)的差異表達(dá)候選基因分析
第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 主要創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
英文縮略詞表
致謝



本文編號：3667555