目的利用CRISPR/Cas9技術與同源重組技術在組蛋白去甲基化酶Kdm2b基因的特定位置敲入雙loxp序列,為后期制備條件性敲除鼠及基因功能研究提供基礎。方法利用CRISPR/Cas9靶向性原理,根據(jù)Kdm2b基因第7個外顯子的5臂端和第9個外顯子的3臂端設計兩個sgRNA,構建sgRNA-PX459重組質粒。從Kdm2b基因上克隆出同源臂,將同源臂插入帶有l(wèi)oxp序列的Vector 5中,利用引物從Vector 5質�？寺〉玫絣oxp-同源臂序列的雙鏈Donor DNA。通過脂質體轉染將sgRNA-PX459重組質粒和雙鏈Donor DNA導入小鼠NIH3T3細胞,利用嘌呤霉素篩選細胞,挑選陽性單克隆。提取NIH3T3細胞基因組進行PCR,對PCR產物酶切鑒定,同時對Kdm2b基因進行測序。結果電泳和測序結果顯示sgRNA-PX459重組質粒構建成功,雙鏈Donor DNA測序結果與設計相符合,成功在NIH3T3細胞Kdm2b基因上第7個外顯子的5臂端和第9個外顯子的3臂端各敲入一個loxp序列。結論獲得Kdm2b基因敲入雙loxp序列的NIH3T3細胞株。 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要實驗材料
    1.2 定點切割雙鏈基因組DNA的sgRNA表達載體的構建
    1.3 帶有l(wèi)oxp序列的雙鏈Donor DNA的設計與構建
    1.4 特定切割位點loxp序列敲入
        1.4.1 sgRNA5切割位點的loxp序列敲入
        1.4.2 sgRNA3切割位點的loxp序列敲入
2 結果
3 討論



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