甘藍型油菜（Brassica napus L.）是我國重要的油料作物,在長江中下游流域大量種植。不僅可用來生產食用油,而且其餅粕富含蛋白質,也可作為動物飼料。由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是一種世界性重要病害,嚴重威脅著我國油菜的生產。生產上多采用化學法防治菌核病,但是存在著很多問題。近年來,植物GDSL脂肪酶家族基因功能的研究逐漸開展,但是關于甘藍型油菜GDSL脂肪酶功能的研究較少,特別是抗菌核病領域。本研究中我們通過候選基因關聯(lián)分析的方法,篩選到了一個與甘藍型油菜菌核病抗性性狀顯著相關的基因,并圍繞該基因進行了一系列研究工作。本研究的主要結果如下:我們克隆了這個與甘藍型油菜菌核病抗性性狀顯著相關的基因,命名為BnGLIP1（B.napus GDSL LIPASE-LIKE 1）。首先通過生物信息學分析方法初步了解了BnGLIP1蛋白的性質,結果發(fā)現(xiàn)它屬于植物SGNH脂肪酶家族,由360個氨基酸組成,含有20種氨基酸,分子質量約為39.5 KD,理論等電點為4.95。預測結果顯示該蛋白磷酸化程度較高,此外它可能是一種親水性蛋白。BnGLIP1... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 油菜具有重要的農業(yè)生產地位
    1.2 植物抗病機制的研究進展
    1.3 核盤菌生物學特征及致病機理
        1.3.1 核盤菌生物學特征
        1.3.2 核盤菌的致病機理
    1.4 植物GDSL脂肪酶家族研究進展
        1.4.1 植物GDSL脂酶結構與種類
        1.4.2 植物GDSL脂酶的生物學功能
    1.5 油菜抗菌核病研究進展
    1.6 研究的目的和意義
    1.7 研究內容和技術路線
        1.7.1 主要研究內容
        1.7.2 技術路線
第二章 BnGLIP1基因的鑒定與克隆
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 候選基因關聯(lián)分析
        2.2.2 RNA的提取以及cDNA的合成
        2.2.3 BnGLIP1基因的克隆
        2.2.4 重組載體pMD18-T-BnGLIP1載體的構建
        2.2.5 抽提質粒送測序
    2.3 結果
        2.3.1 AtGDSL1同源基因的鑒定
        2.3.2 候選基因關聯(lián)分析
        2.3.3 BnGLIP1基因的克隆
    2.4 討論和小結
第三章 甘藍型油菜BnGLIP1蛋白的生物信息學分析
    3.1 生物信息學分析方法
        3.1.1 蛋白保守結構域分析
        3.1.2 蛋白理化性質分析
        3.1.3 蛋白磷酸化位點和疏水性分析
        3.1.4 蛋白信號肽和亞細胞定位預測
    3.2 結果與分析
        3.2.1 BnGLIP1蛋白的保守結構域分析
        3.2.2 BnGLIP1的理化性質以及疏水性分析
        3.2.3 BnGLIP1的磷酸化位點預測
        3.2.4 BnGLIP1的信號肽以及亞細胞定位預測分析
    3.3 討論與小結
第四章 BnGLIP1的表達模式分析以及脅迫響應
    4.1 材料和試劑
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要試劑配制
    4.2 方法
        4.2.1 植株生長條件
        4.2.2 組織表達模式分析
        4.2.3 生物激素的處理
        4.2.4 非生物脅迫處理
        4.2.5 生物脅迫處理
        4.2.6 RNA提取以及cDNA合成
        4.2.7 熒光定量PCR
    4.3 結果與分析
        4.3.1 BnGLIP1的組織表達模式分析
        4.3.2 BnGLIP1在不同激素處理下的響應分析
        4.3.3 BnGLIP1在不同環(huán)境脅迫下的響應分析
        4.3.4 BnGLIP1在核盤菌處理后的表達分析
    4.4 討論與小結
第五章 BnGLIP1蛋白的亞細胞定位分析
    5.1 材料和試劑
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 菌種與載體
        5.1.3 主要試劑
        5.1.4 主要試劑配制方法
    5.2 實驗方法
        5.2.1 亞細胞定位載體的構建
        5.2.2 農桿菌GV3101感受態(tài)細胞的重組載體轉化
        5.2.3 BnGLIP1在煙草葉片中的瞬時轉化
        5.2.4 亞細胞定位觀察
    5.3 結果與分析
        5.3.1 亞細胞定位載體pK7FWG2.0-BnGLIP1的構建
        5.3.2 BnGLIP1蛋白在煙草葉片中的亞細胞定位
    5.4 討論與小結
第六章 過量表達BnGLIP1提高了植株對菌核病的抗性
    6.1 材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 菌種與載體
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 主要試劑配制
    6.2 實驗方法
        6.2.1 過表達載體的構建
        6.2.2 在煙草葉片中瞬時轉化BnGLIP1
        6.2.3 核盤菌侵染瞬時表達BnGLIP1的煙草
        6.2.4 擬南芥的遺傳轉化
        6.2.5 擬南芥遺傳轉化株的篩選與鑒定
        6.2.6 核盤菌侵染擬南芥轉化株
        6.2.7 臺盼藍染色
    6.3 結果與分析
        6.3.1 過表達載體pBI121-BnGLIP1的構建
        6.3.2 瞬時表達BnGLIP1增強煙草對核盤菌的抗性
        6.3.3 擬南芥遺傳轉化株的篩選與鑒定
        6.3.4 核盤菌侵染擬南芥
        6.3.5 臺盼藍染色檢測細胞壞死
        6.3.6 核盤菌菌絲生長差異
    6.4 討論與小結
第七章 BnGLIP1過量表達和抑制表達油菜株系的創(chuàng)建
    7.1 材料
        7.1.1 植物材料
        7.1.2 菌種與載體
        7.1.3 主要試劑
    7.2 實驗方法
        7.1.1 BnGLIP1的抑制表達載體的構建
        7.1.2 油菜遺傳轉化培養(yǎng)基的配制
        7.1.3 甘藍型油菜的遺傳轉化
        7.1.4 油菜陽性轉化株的PCR鑒定
        7.1.5 油菜陽性轉化株的qRT-PCR鑒定
    7.3 結果與分析
        7.3.1 BnGLIP1抑制表達載體的構建
        7.3.2 轉化株的PCR鑒定
        7.3.3 qRT-PCR鑒定BnGLIP1過表達植株以及干擾植株
    7.4 討論與小結
第八章 總結與展望
    8.1 工作總結
    8.2 工作展望
參考文獻
致謝
在學期間發(fā)表的學術論文及其他科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]2017年油料和食用植物油市場形勢分析及2018年展望[J]. 張雯麗,許國棟.  農業(yè)展望. 2018(02)
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碩士論文
[1]甘藍型油菜BnMPK3抗菌核病功能研究[D]. 陳婷.江蘇大學 2016
[2]通過調控GDSL轉錄水平提高甘藍型油菜抗菌核病、種子萌發(fā)速度和含油量[D]. 郭小娟.江蘇大學 2016



本文編號：3663822