豬腸道疾病是全球養(yǎng)豬業(yè)的主要威脅,已造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。包括傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）在內(nèi)的多種冠狀病毒,已確定為豬腸道疾病的主要病原體,但對(duì)于這些疾病的防控依然缺乏有效手段。TGEV和PEDV的宿主細(xì)胞是小腸絨毛上皮細(xì)胞,存在于該細(xì)胞表面中的氨肽酶N（Aminopeptidase-N,APN）可能是TGEV和PEDV進(jìn)入細(xì)胞的受體。目前關(guān)于TGEV和PEDV與APN之間互作關(guān)系的研究主要集中在細(xì)胞水平上,并且APN是否是PEDV的細(xì)胞受體依然存在爭(zhēng)議。因此,本研究著重于APN基因編輯仔豬是否具有抗TGEV和PEDV感染的能力,以此來(lái)探討APN在病毒感染中的作用,從而為抗病育種提供一些參考。首先,本研究利用CRISPR/Cas9n基因編輯系統(tǒng),通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并結(jié)合流式細(xì)胞儀篩選出GFP表達(dá)的細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得單克隆細(xì)胞系,隨機(jī)挑選19個(gè)單克隆,其中16個(gè)為APN雙等位基因編輯,編輯效率為84.3%,基因編輯形式包括D... 

【文章頁(yè)數(shù)】：109 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 基因編輯技術(shù)概述
        1.1 基因編輯歷史簡(jiǎn)述
        1.2 鋅指核酸酶
        1.3 類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶
        1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
        1.5 不同基因編輯方法的優(yōu)缺點(diǎn)
    2 基因編輯技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用
        2.1 基因編輯動(dòng)物的生產(chǎn)方法
            2.1.1 原核注射
            2.1.2 慢病毒載體法
            2.1.3 精子載體法
            2.1.4 體細(xì)胞核移植
            2.1.5 胞質(zhì)注射
        2.2 基因編輯技術(shù)在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用
            2.2.1 改善家畜生產(chǎn)性能
            2.2.2 提高抗病性
            2.2.3 改良奶品質(zhì)量
            2.2.4 建立人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型
    3 仔豬腹瀉與氨肽酶N的研究概述
        3.1 氨肽酶N概述
        3.2 豬冠狀病毒概述
        3.3 豬冠狀病毒發(fā)病機(jī)制和臨床癥狀
        3.4 豬冠狀病毒的免疫反應(yīng)
        3.5 豬氨肽酶N與豬冠狀病毒之間的關(guān)系
    4 研究目的與意義
第二章 利用CRISPR/Cas9n基因編輯系統(tǒng)建立APN基因編輯豬胎兒成纖維系
    引言
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞與載體
        1.2 主要試劑和耗材
            1.2.1 主要試劑
            1.2.2 主要耗材
            1.2.3 試劑配制
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 實(shí)驗(yàn)方法
            1.4.1 設(shè)計(jì)針對(duì)APN基因的sgRNA
            1.4.2 sgRNA雙鏈退火
            1.4.3 構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)sgRNA-A213和sgRNA-A258的質(zhì)粒載體
            1.4.4 構(gòu)建同時(shí)表達(dá)sgRNA-A213和sgRNA-A258的質(zhì)粒載體
            1.4.5 瓊脂糖凝膠回收
            1.4.6 質(zhì)粒純化
            1.4.7 豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
            1.4.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選
            1.4.9 基因組提取
            1.4.10 APN基因編輯細(xì)胞克隆點(diǎn)的鑒定及基因型分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 豬APN基因編輯載體的構(gòu)建分析
        2.2 APN基因編輯豬胎兒成纖維細(xì)胞的篩選與鑒定
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 APN基因編輯克隆豬生產(chǎn)
    引言
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑與耗材
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 試劑配制
            1.1.3 主要耗材
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 實(shí)驗(yàn)方法
            1.3.1 豬卵母細(xì)胞體外成熟
            1.3.2 體細(xì)胞核移植卵母細(xì)胞及供體細(xì)胞準(zhǔn)備
            1.3.3 體細(xì)胞核移植
            1.3.4 重構(gòu)胚胎的融合、激活和培養(yǎng)
            1.3.5 卵母細(xì)胞孤雌激活
            1.3.6 APN基因編輯豬耳成纖維細(xì)胞系建立
            1.3.7 胚胎移植
            1.3.8 APN基因編輯克隆豬的基因型鑒定
            1.3.9 蛋白免疫印跡
    2 結(jié)果與分析
        2.1 APN基因編輯對(duì)核移植胚胎發(fā)育的影響
        2.2 胚胎移植和仔豬生產(chǎn)
        2.3 APN基因編輯克隆豬的DNA和蛋白鑒定
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 APN基因編輯仔豬對(duì)TGEV和PEDV的抗性研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 細(xì)胞與病毒
        1.2 主要試劑與耗材
            1.2.1 主要試劑
            1.2.1 主要耗材
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 實(shí)驗(yàn)方法
            1.4.1 病毒培養(yǎng)
            1.4.2 APN基因編輯仔豬攻毒前準(zhǔn)備
            1.4.3 APN基因編輯仔豬攻毒
            1.4.4 APN基因編輯仔豬攻毒分組
            1.4.5 觀察發(fā)病情況
            1.4.6 病理剖解
            1.4.7 腸道組織蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化
            1.4.8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)糞便及腸道內(nèi)容物中病毒含量
            1.4.9 熒光定量PCR檢測(cè)糞便及腸道內(nèi)容物中病毒RNA含量
        1.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 APN基因編輯豬TGEV攻毒結(jié)果
        2.2 APN基因編輯豬PEDV攻毒結(jié)果
    3 討論
    4 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附表
    附圖
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雜交F1代myostatin基因編輯肉牛的肉質(zhì)特性分析[J]. 王鑫,高廣琦,魏著英,白春玲,佟彬,韓紅燕,張立,李光鵬.  中國(guó)牛業(yè)科學(xué). 2018(03)
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[3]受精卵注射CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備基因編輯子午嶺黑山羊技術(shù)體系的建立[J]. 于鴻浩,朱海鯨,劉錦旺,李隴平,秦劍平,郭小軍,張順,陳生會(huì),屈雷.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2018(03)
[4]基因組編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用[J]. 黃嬌嬌,曹春偉,鄭國(guó)民,趙建國(guó).  遺傳. 2017(11)
[5]豬腹瀉病因的分析和防治原則[J]. 傅大華.  中國(guó)動(dòng)物保健. 2017(06)
[6]基因編輯技術(shù)在豬現(xiàn)代育種和動(dòng)物模型構(gòu)建中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 張霞,劉曉研,苗義良.  中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2017(05)

博士論文
[1]基于CRISPR/Cas9的豬胚胎成纖維細(xì)胞基因組編輯及MSTN基因遺傳修飾豬的制備[D]. 王侃侃.吉林大學(xué) 2018
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[3]Myostatin基因編輯梅山豬的制備與表型分析[D]. 錢(qián)麗麗.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]TALENs介導(dǎo)的人α-乳白蛋白基因定點(diǎn)敲入β-乳球蛋白位點(diǎn)奶山羊生產(chǎn)[D]. 朱紅梅.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[5]利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)豬克隆胚胎的研究[D]. 張運(yùn)海.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)綿羊MSTN基因編輯的研究[D]. 魏海霞.石河子大學(xué) 2018
[2]利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除綿羊[D]. 肖小帥.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]小鼠受精卵顯微注射技術(shù)的優(yōu)化以及Trex1敲除小鼠的構(gòu)建[D]. 韋劍輝.福建師范大學(xué) 2016
[4]TGEV感染的ST細(xì)胞mRNA和lncRNA表達(dá)譜變化及其功能預(yù)測(cè)[D]. 潘開(kāi)源.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[5]TALENs介導(dǎo)的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究[D]. 朱孟敏.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[6]CRISPR/CAS9與TALENs介導(dǎo)奶山羊β-酪蛋白位點(diǎn)基因打靶效率的比較研究[D]. 劉暢.內(nèi)蒙古大學(xué) 2016
[7]利用RNA干擾和乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗腹瀉病轉(zhuǎn)基因豬育種新材料的研究[D]. 陳建文.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[8]豬克隆胚胎生產(chǎn)技術(shù)及組蛋白乙酰化免疫熒光染色技術(shù)優(yōu)化[D]. 曹祖兵.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3658424