豬腸道疾病是全球養(yǎng)豬業(yè)的主要威脅,已造成重大的經(jīng)濟損失。包括傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）在內(nèi)的多種冠狀病毒,已確定為豬腸道疾病的主要病原體,但對于這些疾病的防控依然缺乏有效手段。TGEV和PEDV的宿主細胞是小腸絨毛上皮細胞,存在于該細胞表面中的氨肽酶N（Aminopeptidase-N,APN）可能是TGEV和PEDV進入細胞的受體。目前關于TGEV和PEDV與APN之間互作關系的研究主要集中在細胞水平上,并且APN是否是PEDV的細胞受體依然存在爭議。因此,本研究著重于APN基因編輯仔豬是否具有抗TGEV和PEDV感染的能力,以此來探討APN在病毒感染中的作用,從而為抗病育種提供一些參考。首先,本研究利用CRISPR/Cas9n基因編輯系統(tǒng),通過細胞轉染,并結合流式細胞儀篩選出GFP表達的細胞,通過細胞培養(yǎng)獲得單克隆細胞系,隨機挑選19個單克隆,其中16個為APN雙等位基因編輯,編輯效率為84.3%,基因編輯形式包括D... 

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 基因編輯技術概述
        1.1 基因編輯歷史簡述
        1.2 鋅指核酸酶
        1.3 類轉錄激活因子效應物核酸酶
        1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
        1.5 不同基因編輯方法的優(yōu)缺點
    2 基因編輯技術在畜牧生產(chǎn)中的應用
        2.1 基因編輯動物的生產(chǎn)方法
            2.1.1 原核注射
            2.1.2 慢病毒載體法
            2.1.3 精子載體法
            2.1.4 體細胞核移植
            2.1.5 胞質(zhì)注射
        2.2 基因編輯技術在家畜生產(chǎn)中的應用
            2.2.1 改善家畜生產(chǎn)性能
            2.2.2 提高抗病性
            2.2.3 改良奶品質(zhì)量
            2.2.4 建立人類疾病的動物模型
    3 仔豬腹瀉與氨肽酶N的研究概述
        3.1 氨肽酶N概述
        3.2 豬冠狀病毒概述
        3.3 豬冠狀病毒發(fā)病機制和臨床癥狀
        3.4 豬冠狀病毒的免疫反應
        3.5 豬氨肽酶N與豬冠狀病毒之間的關系
    4 研究目的與意義
第二章 利用CRISPR/Cas9n基因編輯系統(tǒng)建立APN基因編輯豬胎兒成纖維系
    引言
    1 材料與方法
        1.1 細胞與載體
        1.2 主要試劑和耗材
            1.2.1 主要試劑
            1.2.2 主要耗材
            1.2.3 試劑配制
        1.3 主要儀器設備
        1.4 實驗方法
            1.4.1 設計針對APN基因的sgRNA
            1.4.2 sgRNA雙鏈退火
            1.4.3 構建單獨表達sgRNA-A213和sgRNA-A258的質(zhì)粒載體
            1.4.4 構建同時表達sgRNA-A213和sgRNA-A258的質(zhì)粒載體
            1.4.5 瓊脂糖凝膠回收
            1.4.6 質(zhì)粒純化
            1.4.7 豬胎兒成纖維細胞培養(yǎng)
            1.4.8 細胞轉染及篩選
            1.4.9 基因組提取
            1.4.10 APN基因編輯細胞克隆點的鑒定及基因型分析
    2 結果與分析
        2.1 豬APN基因編輯載體的構建分析
        2.2 APN基因編輯豬胎兒成纖維細胞的篩選與鑒定
    3 討論
    4 小結
第三章 APN基因編輯克隆豬生產(chǎn)
    引言
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑與耗材
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 試劑配制
            1.1.3 主要耗材
        1.2 主要儀器設備
        1.3 實驗方法
            1.3.1 豬卵母細胞體外成熟
            1.3.2 體細胞核移植卵母細胞及供體細胞準備
            1.3.3 體細胞核移植
            1.3.4 重構胚胎的融合、激活和培養(yǎng)
            1.3.5 卵母細胞孤雌激活
            1.3.6 APN基因編輯豬耳成纖維細胞系建立
            1.3.7 胚胎移植
            1.3.8 APN基因編輯克隆豬的基因型鑒定
            1.3.9 蛋白免疫印跡
    2 結果與分析
        2.1 APN基因編輯對核移植胚胎發(fā)育的影響
        2.2 胚胎移植和仔豬生產(chǎn)
        2.3 APN基因編輯克隆豬的DNA和蛋白鑒定
    3 討論
    4 小結
第四章 APN基因編輯仔豬對TGEV和PEDV的抗性研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 細胞與病毒
        1.2 主要試劑與耗材
            1.2.1 主要試劑
            1.2.1 主要耗材
        1.3 主要儀器設備
        1.4 實驗方法
            1.4.1 病毒培養(yǎng)
            1.4.2 APN基因編輯仔豬攻毒前準備
            1.4.3 APN基因編輯仔豬攻毒
            1.4.4 APN基因編輯仔豬攻毒分組
            1.4.5 觀察發(fā)病情況
            1.4.6 病理剖解
            1.4.7 腸道組織蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化
            1.4.8 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)糞便及腸道內(nèi)容物中病毒含量
            1.4.9 熒光定量PCR檢測糞便及腸道內(nèi)容物中病毒RNA含量
        1.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 APN基因編輯豬TGEV攻毒結果
        2.2 APN基因編輯豬PEDV攻毒結果
    3 討論
    4 小結
全文結論
參考文獻
附錄
    附表
    附圖
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雜交F1代myostatin基因編輯肉牛的肉質(zhì)特性分析[J]. 王鑫,高廣琦,魏著英,白春玲,佟彬,韓紅燕,張立,李光鵬.  中國牛業(yè)科學. 2018(03)
[2]利用CRISPR/Cas9n技術生產(chǎn)抗藍耳病的基因編輯克隆豬[J]. 王少華,趙盼盼,劉通,丁彪,羅磊,曹祖兵,張運海,張坤.  浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版). 2018(02)
[3]受精卵注射CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備基因編輯子午嶺黑山羊技術體系的建立[J]. 于鴻浩,朱海鯨,劉錦旺,李隴平,秦劍平,郭小軍,張順,陳生會,屈雷.  中國科學:生命科學. 2018(03)
[4]基因組編輯技術在豬遺傳改良中的應用[J]. 黃嬌嬌,曹春偉,鄭國民,趙建國.  遺傳. 2017(11)
[5]豬腹瀉病因的分析和防治原則[J]. 傅大華.  中國動物保健. 2017(06)
[6]基因編輯技術在豬現(xiàn)代育種和動物模型構建中應用的研究進展[J]. 張霞,劉曉研,苗義良.  中國細胞生物學學報. 2017(05)

博士論文
[1]基于CRISPR/Cas9的豬胚胎成纖維細胞基因組編輯及MSTN基因遺傳修飾豬的制備[D]. 王侃侃.吉林大學 2018
[2]豬著床前胚胎發(fā)育過程中WDR5的作用及其機制[D]. 丁彪.安徽農(nóng)業(yè)大學 2017
[3]Myostatin基因編輯梅山豬的制備與表型分析[D]. 錢麗麗.中國農(nóng)業(yè)大學 2016
[4]TALENs介導的人α-乳白蛋白基因定點敲入β-乳球蛋白位點奶山羊生產(chǎn)[D]. 朱紅梅.西北農(nóng)林科技大學 2016
[5]利用體細胞核移植技術生產(chǎn)豬克隆胚胎的研究[D]. 張運海.中國農(nóng)業(yè)大學 2005

碩士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)對綿羊MSTN基因編輯的研究[D]. 魏海霞.石河子大學 2018
[2]利用CRISPR/Cas9技術制備MSTN基因敲除綿羊[D]. 肖小帥.河南農(nóng)業(yè)大學 2017
[3]小鼠受精卵顯微注射技術的優(yōu)化以及Trex1敲除小鼠的構建[D]. 韋劍輝.福建師范大學 2016
[4]TGEV感染的ST細胞mRNA和lncRNA表達譜變化及其功能預測[D]. 潘開源.安徽農(nóng)業(yè)大學 2016
[5]TALENs介導的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究[D]. 朱孟敏.揚州大學 2016
[6]CRISPR/CAS9與TALENs介導奶山羊β-酪蛋白位點基因打靶效率的比較研究[D]. 劉暢.內(nèi)蒙古大學 2016
[7]利用RNA干擾和乳腺生物反應器生產(chǎn)抗腹瀉病轉基因豬育種新材料的研究[D]. 陳建文.安徽農(nóng)業(yè)大學 2012
[8]豬克隆胚胎生產(chǎn)技術及組蛋白乙�；庖邿晒馊旧夹g優(yōu)化[D]. 曹祖兵.安徽農(nóng)業(yè)大學 2010



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