目的探討乳桿菌bsh基因的高效表達及膽鹽水解酶（BSH）的高活性酶蛋白獲得。方法從本實驗室保存的12株乳桿菌菌株中,通過Ca²⁺沉淀法初篩獲得具BSH活性的菌株,根據(jù)GenBank上公布的16S rRNA同源性最高的乳桿菌的BSH全基因序列,設計特異性引物,PCR擴增獲得bsh基因并克隆至表達載體pET-28α,構建BL21-pET-28α-bsh原核表達體系。經(jīng)IPTG誘導后,對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析及Western blot驗證。結果研究表明在分子質量大小約35、37 kD處有預期條帶出現(xiàn),初步表明BSH蛋白表達成功。進而對表達各條件進行優(yōu)化,最佳酶活條件為IPTG濃度0.1 mmol/L、誘導pH 6.5、誘導溫度37℃、誘導時間1 h。經(jīng)鎳柱親和層析純化制備BSH制劑,鄰苯三酚紅鉬法蛋白濃度測定為1 446 mg/dL,茚三酮法測酶活性最高可達21 248.27 U/（g·prot）,為純化前的635.4倍。結論乳桿菌bsh基因可溶性表達成功且高酶活BSH純化獲取為進一步的研究和藥物轉化奠定基礎。 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株及質粒
        1.1.2 主要試劑與儀器設備
        1.1.3 培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 具有膽鹽水解酶的乳桿菌菌株
        1.2.2 不同菌株對膽固醇去除率的測定
        1.2.3 乳桿菌總DNA的提取
        1.2.4 16S rRNA鑒定乳桿菌菌種
        1.2.5 不同乳桿菌bsh基因的擴增
        1.2.6 bsh基因的克隆與轉化子驗證
        1.2.7 bsh基因原核表達體系的構建
        1.2.8 BSH蛋白的誘導表達
        1.2.9 重組蛋白的Western blot驗證
        1.2.10 原核表達條件的優(yōu)化
        1.2.11 鎳柱親和層析純化BSH及SDS-PAGE檢測
        1.2.12 茚三酮法測定BSH純酶制劑酶活性單位
    1.3 統(tǒng)計方法
2 結 果
    2.1 MRS-THIO-OX培養(yǎng)基中產(chǎn)BSH菌株篩選
    2.2 不同乳桿菌的BSH酶對膽固醇去除效果比較
    2.3 16S rRNA乳桿菌鑒定
    2.4 bsh基因的擴增
    2.5 重組蛋白BSH的SDS-PAGE鑒定
    2.6 重組蛋白的Western blot分析
    2.7 BSH蛋白表達條件的優(yōu)化
    2.8 BSH 酶活的再次驗證
    2.9 BSH酶制劑的純化與SDS-PAGE分析
    2.10 BSH酶活性單位測定(茚三酮法)
3 討 論
    3.1 結果分析
    3.2 研究的意義


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雙歧桿菌膽鹽水解酶基因的重組表達、純化與酶學性質[J]. 周曉玲,張娟,陳堅,堵國成.  食品與生物技術學報. 2016(08)
[2]膽鹽水解酶基因結構與功能研究現(xiàn)狀[J]. 黃艷娜,任婧.  乳業(yè)科學與技術. 2015(02)
[3]乳酸菌降膽固醇作用研究進展[J]. 廖宇欣,錢麗麗,于長青.  農產(chǎn)品加工(學刊). 2013(08)



本文編號：3658130