鴨源雞桿菌是巴氏桿菌科雞桿菌屬的代表種,為革蘭氏陰性菌。研究表明其在一定條件下能夠引起蛋雞生殖系統(tǒng)的損傷、腹膜炎及敗血癥和呼吸道疾病等,造成產(chǎn)蛋量下降,死亡率上升。鴨源雞桿菌存在多重耐藥性及固有抗原的多樣性,這使得抗生素及疫苗對該病的防治效果不甚理想,給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失越來越嚴(yán)重。目前,鴨源雞桿菌致病機(jī)理的研究還十分有限,僅有少數(shù)幾個(gè)預(yù)測的毒力因子得到的確認(rèn),其中包括新型的RTX毒素Gtx A、多糖莢膜、金屬蛋白酶和粘附素等。本試驗(yàn)首次針對鴨源雞桿菌外膜蛋白W（OmpW）開展了初步研究,首先借助PCR及生物信息學(xué)方法,獲得了OmpW基因在鴨源雞桿菌中分布狀態(tài)、預(yù)測了其可能存在的抗原表位,并利用鴨源雞桿菌OmpW的原核表達(dá)產(chǎn)物制備多克隆抗體,對其免疫原性進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步的研究OmpW基因的功能,本試驗(yàn)首次在國內(nèi)利用靶向基因操作技術(shù)成功構(gòu)建了鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因突變株Δomp W。1.鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析本研究參照GenBank中公布的UMN179的OmpW基因序列,設(shè)計(jì)一對通用引物,通過PCR對32株不同來源的鴨源雞桿菌OmpW基因進(jìn)行擴(kuò)增,首次對鴨源... 

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
英文縮寫詞表
摘要
文獻(xiàn)綜述
    1 雞桿菌概述
        1.1 雞桿菌分類地位的確立
        1.2 雞桿菌的致病性
        1.3 鴨源雞桿菌主要毒力因子
    2 外膜蛋白
        2.1 外膜蛋白概述
        2.2 外膜蛋白W（Outer membrane protein W, OmpW）
    3 基因功能研究方法
        3.1 基因生物信息學(xué)分析
        3.2 基因的表達(dá)譜分析
        3.3 蛋白相互作用研究
        3.4 基因功能的實(shí)驗(yàn)學(xué)驗(yàn)證
    4 基因敲除(Gene knock)技術(shù)
        4.1 隨機(jī)插入突變法
        4.2 基因重組技術(shù)
        4.3 RNA干擾
    5 基因敲除技術(shù)在鴨源雞桿菌中的應(yīng)用
    6 小結(jié)
試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一 鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因克隆及生物信息學(xué)分析
        引言
        1 材料與方法
            1.1 菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.5 細(xì)菌的培養(yǎng)
            1.6 OmpW基因的擴(kuò)增及測序
            1.7 OmpW核苷酸及編碼氨基酸序列分析
            1.8 OmpW理化性質(zhì)分析
            1.9 OmpW信號肽及結(jié)構(gòu)分析
            1.10 OmpW B細(xì)胞抗原表位預(yù)測
        2 結(jié)果與分析
            2.1 OmpW基因的PCR擴(kuò)增
            2.2 OmpW核苷酸序列分析
            2.3 OmpW氨基酸同源性分析
            2.4 OmpW的理化性質(zhì)
            2.5 OmpW信號肽及結(jié)構(gòu)分析
            2.6 OmpW線性B細(xì)胞抗原表位預(yù)測
        3 討論
    試驗(yàn)二 鴨源雞桿菌外膜蛋白W基因的表達(dá)及抗原性鑒定
        前言
        1 材料和方法
            1.1 菌株和質(zhì)粒
            1.2 酶及主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 引物設(shè)計(jì)及合成
            1.5 細(xì)菌基因組DNA的制備
            1.6 OmpW基因的擴(kuò)增
            1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
            1.8 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
            1.9 OmpW蛋白的純化和Western blot鑒定
            1.10 多克隆抗體的制備及鑒定
        2 結(jié)果與分析
            2.1 OmpW基因的擴(kuò)增
            2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
            2.4 原核表達(dá)OmpW Western blotting鑒定
            2.5 OmpW免疫原性分析
        3 討論
    試驗(yàn)三 鴨源雞桿菌OmpW基因敲除株的構(gòu)建
        引言
        1 菌株與材料
            1.1 菌株與質(zhì)粒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        2 方法
            2.1 國內(nèi)菌株自然感受基因的檢測
            2.2 鴨源雞桿菌ΔOmpW突變株的構(gòu)建
        3 結(jié)果與分析
            3.1 鴨源雞桿菌PDS-RZ-1-SLG基因組含有自然感受基因
            3.2 主要自然感受相關(guān)基因測定
            3.3 OmpW基因上下游同源臂及CMP抗性盒子的擴(kuò)增
            3.4 pUC18-S-C-X質(zhì)粒的酶切鑒定
            3.5 鴨源雞桿菌突變株的鑒定
        4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附:作者讀研期間發(fā)表文章
ABSTRACT


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴨源雞桿菌致病力與生物被膜形成能力及耐藥性的相關(guān)性分析研究[J]. 張秀平,陳陸,趙軍,王川慶,王新衛(wèi),常洪濤,劉紅英,盧彩景,楊霞.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(10)
[2]大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpW基因敲除菌的構(gòu)建及其對兩種抗生素的敏感性[J]. 吳賢斌,鄒海杰,田麗花,潘建義,趙輔昆.  微生物學(xué)報(bào). 2012(08)
[3]我國部分地區(qū)蛋雞群鴨源雞桿菌血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 王珊,陳陸,付仁一,楊霞,趙軍,高冬生,李喬晶,姚惠霞,王川慶.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(02)
[4]基因敲除技術(shù)及其在微生物育種中的應(yīng)用[J]. 張紅巖,申乃坤,周興.  釀酒科技. 2010(04)
[5]45株雞卡氏桿菌的分離鑒定[J]. 鄭鹿平,楊霞,陳陸,皇甫和平,劉慧敏,郭倫濤,徐雪,付仁一,王澤霖,王川慶.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(03)
[6]基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構(gòu)建腸炎沙門氏菌突變株方法的比較[J]. 朱春紅,孫曉慶,何素芬,朱國強(qiáng).  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(02)
[7]蛋雞群卡氏桿菌感染情況的初步研究[J]. 王川慶,陳陸,楊霞,皇甫和平,劉紅英,彭志峰,鄭鹿平,徐雪,劉惠敏,付仁一,郭輪濤.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(03)
[8]一種新的基因敲除術(shù)-RNAi[J]. 李穎平,張映,邵國青.  生物技術(shù)通報(bào). 2006(03)
[9]植物功能基因組研究中的基因敲除技術(shù)[J]. 陳其軍,肖玉梅,王學(xué)臣,周海夢.  植物生理學(xué)通訊. 2004(01)
[10]細(xì)菌耐藥機(jī)制與臨床治療對策[J]. 王睿,柴棟.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊). 2003(03)

碩士論文
[1]鐵離子調(diào)節(jié)革蘭氏陰性菌外膜蛋白OmpW抗宿主氧化應(yīng)激作用及機(jī)制的研究[D]. 鄒海杰.浙江理工大學(xué) 2012
[2]61株鴨源雞桿菌部分耐藥基因及其與耐藥性關(guān)系的研究[D]. 高冬生.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]雞桿菌地方分離株耐藥性及耐藥基因的研究[D]. 郭倫濤.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號：3652818