香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴�；停‵usariumoxysporumf.sp.cubense,Foc）引起的一種難于防治的嚴(yán)重土傳維管束真菌病害,給國內(nèi)外香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在香蕉枯萎病的防治方面,國內(nèi)外主要是從物理防治、化學(xué)防治、生物防治、抗病選育及綜合防控等幾個方面入手,進(jìn)行了許多研究探索,但是仍沒能十分有效解決香蕉枯萎病的防治問題。加強(qiáng)香蕉枯萎鐮刀菌的致病機(jī)理研究,對于制定持久有效的香蕉枯萎病防治策略具有十分重要的意義。本研究前期在尖孢鐮刀菌古巴�；�4號小種（Foc4）蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),液泡融合蛋白mon1基因在Foc4侵染巴西蕉的過程中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),推測mon1基因可能在Foc4的致病過程中發(fā)揮了作用。另外,結(jié)合基因轉(zhuǎn)座子對效應(yīng)基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn),flh2基因也可能與尖孢鐮刀菌的致病性相關(guān)。本研究利用重疊PCR的方法構(gòu)建了基因敲除線型同源片段,利用EZ fusion同源重組酶對PCT74質(zhì)粒進(jìn)行兩次改造,以新霉素G418抗性基因替換掉PCT74質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因,以互補(bǔ)基因片段替換掉PCT74質(zhì)粒中的綠色熒光標(biāo)記基因,以此構(gòu)建互補(bǔ)載體,采用PEG介導(dǎo)的方法進(jìn)... 

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 導(dǎo)論
    1.1 香蕉及其發(fā)展現(xiàn)狀
    1.2 尖孢鐮刀菌
        1.2.1 尖孢鐮刀菌基本概況
        1.2.2 香蕉枯萎病菌的致病機(jī)理
    1.3 香蕉枯萎病
        1.3.1 香蕉枯萎病的基本特征
        1.3.2 香蕉枯萎病的發(fā)生和傳播
        1.3.3 香蕉枯萎病的防治
    1.4 分泌蛋白和液泡融合蛋白
        1.4.1 分泌蛋白及其研究進(jìn)展
        1.4.2 液泡融合蛋白
    1.5 融合PCR法構(gòu)建目的基因敲除線型片段
    1.6 研究的目的和意義
2. 材料與方法
    2.1 材料、儀器和試劑
        2.1.1 材料
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要供試試劑和培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 香蕉尖抱鐮刀菌flh2和mon1基因的生物信息學(xué)分析
        2.2.2 尖孢鐮刀菌4號小種野生型基因組DNA的提取
        2.2.3 pCT74質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.4 flh2和mon1基因敲除同源片段的構(gòu)建
        2.2.5 敲除線型同源片段的PEG轉(zhuǎn)化
        2.2.6 敲除轉(zhuǎn)化子的鑒定
        2.2.7 敲除子表型觀察
        2.2.8 致病性測定分析
        2.2.9 回復(fù)載體的構(gòu)建
        2.2.10 flh2和mon1基因回復(fù)載體的PEG轉(zhuǎn)化
        2.2.11 回復(fù)轉(zhuǎn)化子的鑒定
        2.2.12 回復(fù)子的表型分析以及致病力測定
3. 結(jié)果與分析
    3.1 香蕉尖抱鐮刀菌flh2和mon1基因的生物信息學(xué)分析
        3.1.1 flh2基因和mon1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析
        3.1.2 flh2基因和mon1基因編碼蛋白的信號肽預(yù)測以及亞細(xì)胞定位
        3.1.3 flh2基因和mon1基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測
        3.1.4 flh2基因和mon1基因編碼蛋白的磷酸化修飾以及GPI修飾位點預(yù)測
        3.1.5 flh2基因和mon1基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析
        3.1.6 對flh2和mon1基因編碼蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹
    3.2 基因敲除線性片段構(gòu)建
        3.2.1 同源臂以及潮霉素基因片段的PCR擴(kuò)增
        3.2.2 基因敲除線性片段的連接
    3.3 敲除轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
    3.4 敲除轉(zhuǎn)化子的表型分析
        3.4.1 生長特性分析
        3.4.2 菌絲形態(tài)觀察
        3.4.3 產(chǎn)孢率測定
        3.4.4 脅迫因子敏感性實驗
        3.4.5 玻璃紙穿透性實驗
        3.4.6 致病性測定實驗
    3.5 flh2和mon1基因互補(bǔ)載體的構(gòu)建
    3.6 回復(fù)轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
    3.7 回復(fù)轉(zhuǎn)化子的表型分析及致病力測定
4. 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 香蕉尖抱鐮刀菌flh2和mon1兩個基因的生物信息學(xué)分析
        4.1.2 敲除同源線型片段的構(gòu)建
        4.1.3 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化
        4.1.4 △flh2和△mon1兩個基因敲除突變體的鑒定
        4.1.5 敲除突變體的表型分析
        4.1.6 △flh2和△mon1敲除突變體致病力的測定
        4.1.7 回復(fù)子功能驗證
    4.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
基金項目
論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]香蕉枯萎病菌毒素在香蕉抗病品種選育和抗病性鑒定中的應(yīng)用[D]. 李梅婷.福建農(nóng)林大學(xué) 2010

碩士論文
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[3]禾谷鐮刀菌Metacaspases基因的功能研究[D]. 連佳杰.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[4]稻瘟菌C3HC和C2H2型鋅指蛋白（ZFC3、ZFC2）參與MoLon1致病過程的機(jī)理研究[D]. 劉少帥.吉林大學(xué) 2016
[5]FoHFI1基因在香蕉枯萎病菌致病過程中的作用[D]. 農(nóng)海靜.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[6]香蕉尖孢鐮刀菌fpd1基因敲除與功能研究[D]. 王飛燕.海南大學(xué) 2015
[7]串珠鐮刀菌FvBCK1調(diào)節(jié)細(xì)胞壁完整性、分生孢子發(fā)育及色素的產(chǎn)生[D]. 陶紅.福建農(nóng)林大學(xué) 2012



本文編號：3652169