肌球蛋白（Myosin）是肌原纖維粗絲的重要組成部分,廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織器官中。本試驗(yàn)中我們探究在擬穴青蟹在感染白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）或溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）后,在青蟹的先天免疫過(guò)程中Myosin-9基因所起到的作用。運(yùn)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）,成功獲得Myosin-9基因的序列,該序列長(zhǎng)為2735 bp,其中開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為2145 bp,編碼715個(gè)氨基酸。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析,結(jié)果顯示該基因與凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）親緣關(guān)系較近。檢測(cè)Myosin-9基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量,結(jié)果顯示Myosin-9基因在肌肉的表達(dá)量最高,在心臟、血淋巴、性腺中次之,鰓、肝胰腺等組織內(nèi)表達(dá)量較低。通過(guò)構(gòu)建Myosin-9基因的dsRNA表達(dá)載體,利用dsRNA抑制Myosin-9基因的表達(dá),擬穴青蟹的多個(gè)已知免疫相關(guān)基因的表達(dá)受到影響,其中C-type-lectin的表達(dá)量顯著提高,Tol... 

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

擬穴青蟹Myosin-9與其他物種的氨基酸序列比對(duì)Fig.2ComparationofS.paramamosainMyosin-9aminoacidsequencewithotherspecies

17圖 3 Myosin-9 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of Myosin-91.4 討論本試驗(yàn)中，通過(guò)從 NCBI 上下載不同物種的 Myosin-9 基因序列，尋找保守區(qū)間設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR 技術(shù)獲得核心序列后，通過(guò) RACE 技術(shù)設(shè)計(jì)特異性引物，成功取得 Myosin-9 基因的序列，序列長(zhǎng)度為 2735 bp，開(kāi)放閱讀框大小為 2145bp，編碼一個(gè) 775 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在獲得 Myosin-9 基因序列后，可以利用該序列設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 的引物，設(shè)計(jì)干擾序列對(duì) Myosin-9 基因進(jìn)行敲低，為研究 Myosin-9 基因功能的探究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為其它無(wú)脊椎動(dòng)物包括其余蟹類(lèi)的 Myosin-9基因的克隆提供了一定的參考價(jià)值。

圖 4 Myison-9 基因在各組織中的表達(dá)量Fig.4Expression levels of Myison-9 gene in varioustissuessRNA 體外試驗(yàn)干擾 Myosin-9表達(dá)yosin-9-dsRNA 質(zhì)粒構(gòu)建特異性引物，引物上加入酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增除擬穴青蟹 Myison-9 基因部雙酶切技術(shù)和 T4 DNA Ligase 連接酶將這基因片段轉(zhuǎn)化到 HT115 感受過(guò)測(cè)序的驗(yàn)證，證明了 Myosin-9-L38i 重組質(zhì)粒構(gòu)建完成，可用于后續(xù)Myosin-9-L38i3172 bpMyosin-9oriT7 promoterT7 promoterSalⅠ（439）HindIII (1)Apa LI (2668)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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