蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的紊亂可能是神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵致病機(jī)制之一。肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）就是一類嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病。本研究旨在探索我們新報(bào)道的ALS相關(guān)基因CREST是否會影響蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。我們構(gòu)建了人源CREST的表達(dá)質(zhì)�；蚴笤碈REST shRNA的質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞或從胚胎期C57BL/6小鼠分離培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元中,以此制備實(shí)驗(yàn)樣品。使用分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法,分析了CREST對蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的影響,包括泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和自噬流。利用UPS的GFP指示劑,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CREST會導(dǎo)致293細(xì)胞中GFP陽性信號顯著降低。但CREST的過表達(dá)卻不影響293細(xì)胞或培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中的自噬流。然而,無論在是否使用影響自噬流藥物的情況下,降低CREST的蛋白水平都能抑制培養(yǎng)神經(jīng)元中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化（P<0.05）。不僅如此,LC3-Ⅱ與Ⅰ的比值在表達(dá)CREST的ALS相關(guān)突變（CREST-Q388X）的皮層神經(jīng)元中顯著上升（P<0.05）。上述結(jié)果表明,CREST可能在蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括促進(jìn)UPS以及維持自噬的正常功能,而在... 

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【文章目錄】：
1 Materials and Methods
    1.1 Plasmid construction
    1.2 Cell culture
    1.3 Western blotting
    1.4 Immunofluorescence
    1.5 Statistical analysis
2 Results
    2.1 CREST may promote the activity of ubiquitin proteasome systems in 293 cell lines
    2.2 Overexpression of wild-type CREST may not affect autophagic flux in cultured cells
    2.3 CREST may be necessary for maintaining normal autophagic flux in cultured cortical neurons
    2.4 The LC3-Ⅱ/Ⅰ ratios are increased in CREST-Q388X mutant-expressing cortical neurons
3 Discussion



本文編號：3646403