CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T）細(xì)胞療法自發(fā)展之初至今已有30多年的歷史,該療法在人類的抗癌史中具有里程碑式的意義�，F(xiàn)今各種CAR-T細(xì)胞療法及相關(guān)研究正在如火如荼地進(jìn)行,研究者們正致力于解決CAR-T細(xì)胞治療中遇到的各項挑戰(zhàn)。眾多研究中,ACAT1基因的相關(guān)功能引起了人們的關(guān)注。ACAT1參與編碼膽固醇酯化酶,膽固醇酯化酶能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化為膽固醇酯,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇水平,進(jìn)而影響細(xì)胞的效應(yīng)功能。因此,本課題在NKG2D-CAR-T細(xì)胞療法的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究下調(diào)ACAT1基因表達(dá)對于NKG2D-CAR-T細(xì)胞抗結(jié)直腸癌細(xì)胞的能力及相關(guān)生物學(xué)特性的影響。首先,使用本實驗室已構(gòu)建的質(zhì)粒用于包裝慢病毒。從健康人外周血中分離出T細(xì)胞,用濃縮的病毒感染T細(xì)胞,感染效率達(dá)到90%以上。利用Q-PCR、Western Blot對shRNA干擾ACAT1基因的表達(dá)效率進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)ACAT1基因表達(dá)被下調(diào)了約50%。用效應(yīng)細(xì)胞殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT-8）,隨著效靶比的升高,shACAT1-NKG2D-CAR-T細(xì)胞抗結(jié)直腸癌的作用不斷提升,證明下調(diào)ACAT1基... 

【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 CAR-T細(xì)胞療法
        1.1.1 概述
        1.1.2 CAR-T細(xì)胞療法研究進(jìn)展
        1.1.3 CAR-T的分子結(jié)構(gòu)及作用原理
        1.1.4 CAR-T細(xì)胞療法現(xiàn)存的問題及解決方案
    1.2 結(jié)直腸癌
        1.2.1 概述
        1.2.2 結(jié)直腸癌治療
    1.3 NKG2D靶向
        1.3.1 NKG2D與其配體
        1.3.2 NKG2D-CAR的相關(guān)應(yīng)用
    1.4 膽固醇
        1.4.1 膽固醇簡介
        1.4.2 膽固醇與膽固醇�；D(zhuǎn)移酶1的關(guān)系
    1.5 RNA干擾技術(shù)
        1.5.1 RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用
        1.5.2 RNA干擾技術(shù)的系統(tǒng)組成和作用原理
        1.5.3 RNA干擾技術(shù)的特性
    1.6 研究思路與目標(biāo)
第二章 ACAT1低表達(dá)NKG2D-CAR-T細(xì)胞的制備及檢測
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 細(xì)胞株
        2.2.2 慢病毒質(zhì)粒
        2.2.3 常用實驗試劑
        2.2.4 常用實驗試劑配制方法
        2.2.5 常用實驗儀器
        2.2.6 常用實驗耗材
    2.3 實驗方法
        2.3.1 轉(zhuǎn)化、小提質(zhì)粒并酶切鑒定
        2.3.2 制備三種慢病毒并測定滴度
        2.3.3 制備CAR-T細(xì)胞
        2.3.4 檢測sh RNA-ACAT1干擾效果
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 小提質(zhì)粒酶切鑒定
        2.4.2 三種慢病毒滴度
        2.4.3 CAR-T細(xì)胞陽性率
        2.4.4 shRNA-ACAT1干擾效果
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)對于NKG2D-CAR-T細(xì)胞效應(yīng)功能的影響
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 細(xì)胞
        3.2.2 常用實驗試劑
        3.2.3 常用實驗試劑配制方法
        3.2.4 常用實驗儀器及耗材
    3.3 實驗方法
        3.3.1 檢測MICA/B在 HCT-8 細(xì)胞上的表達(dá)
        3.3.2 流式檢測CRA-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
        3.3.3 檢測CAR-T細(xì)胞活化、脫顆粒水平
        3.3.4 檢測CAR-T細(xì)胞中干擾素γ(IFN-γ)、顆粒酶B(GzmB)的表達(dá)水平
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 MICA/MICB在 HCT-8 細(xì)胞中高水平表達(dá)
        3.4.2 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)增強(qiáng)了NKG2D-CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
        3.4.3 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)增強(qiáng)了NKG2D-CAR-T細(xì)胞激活、脫顆粒水平
        3.4.4 下調(diào)基因表達(dá)提高了NKG2D-CAR-T細(xì)胞的干擾素γ、顆粒酶B的釋放
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四章 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)對CAR-T細(xì)胞耗竭、增殖、分化的影響
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 細(xì)胞
        4.2.2 常用實驗試劑
        4.2.3 常用實驗試劑配制方法
        4.2.4 常用實驗儀器及耗材
    4.3 實驗方法
        4.3.1 檢測CAR-T細(xì)胞的耗竭
        4.3.2 檢測CAR-T細(xì)胞的增殖情況
        4.3.3 檢測CAR-T細(xì)胞的分化情況
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)降低CAR-T細(xì)胞的耗竭
        4.4.2 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖
        4.4.3 下調(diào)ACAT1基因表達(dá)影響CAR-T細(xì)胞的分化
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
第五章 全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
后記



本文編號：3639646