花粉發(fā)育是植物有性生殖的重要一環(huán),花粉壁的正常發(fā)育對于花粉形態(tài)和功能的維持尤為重要�；ǚ蹆�(nèi)壁主要由果膠等組成,果膠的合成和修飾過程若有異常,則會直接影響內(nèi)壁的發(fā)育,進(jìn)而造成花粉萌發(fā)及花粉管生長等異常。果膠甲酯酶（pectinmethylesterase,PME）是果膠側(cè)鏈的一種重要修飾酶,已有研究表明,在擬南芥和白菜中,有數(shù)個PME基因參與花粉內(nèi)壁的形成。擬南芥中至少有15個PME參與花粉發(fā)育,白菜中也有20多個PME與花粉發(fā)育相關(guān),但其中絕大部分PME基因的具體功能還不清楚。研究白菜基因功能的傳統(tǒng)方法主要有誘變、反義干涉、RNA干涉、過表達(dá)等,但由于白菜在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了一次全基因組三倍化事件,導(dǎo)致其基因組內(nèi)同源基因比較多,上述方法在實際應(yīng)用過程中存在很多局限。新興的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以很好地解決這些問題,但白菜中尚未建立起成熟的CRISPR/Cas9體系。本文首先通過生物信息學(xué)的方法對白菜等九種植物的PME基因家族成員進(jìn)行鑒定,再結(jié)合網(wǎng)上公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對這些PME基因進(jìn)行表達(dá)分析;然后找出各個植物中花發(fā)育特異或優(yōu)勢表達(dá)的PME,對其進(jìn)行序列比對和啟動子順式作用元... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
縮略詞
摘要
Abstract
前言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 花粉內(nèi)壁的發(fā)育
        1.1.1 花粉發(fā)育
        1.1.2 成熟花粉壁的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 花粉壁發(fā)育過程
        1.1.4 參與花粉內(nèi)壁發(fā)育的基因
            1.1.4.1 纖維素合成相關(guān)基因
            1.1.4.2 果膠合成相關(guān)基因
            1.1.4.3 果膠側(cè)鏈修飾相關(guān)基因
            1.1.4.4 花粉壁結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因
            1.1.4.5 其他基因
    1.2 PME基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 PME蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PME蛋白的性質(zhì)
        1.2.3 PME蛋白的作用模式
        1.2.4 PME蛋白的抑制子
        1.2.5 PME基因在植物生長發(fā)育中的功能
            1.2.5.1 PME基因在營養(yǎng)生長過程中的功能
            1.2.5.2 PME基因在生殖生長過程中的功能
    1.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物基因組編輯中的應(yīng)用
        1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡介
        1.3.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用
        1.3.3 CRISPR/Cas9體系被廣泛用于植物基因組編輯
        1.3.4 在植物中應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的流程
        1.3.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在脫靶及其他問題
        1.3.6 提高CRISPR/Cas9靶向效率的策略
        1.3.7 獲得不含T-DNA的突變體的方法
2 白菜等九種植物PME基因家族的鑒定及花發(fā)育相關(guān)PME的分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 植物材料和試劑耗材
        2.1.2 植物基因組、基因表達(dá)數(shù)據(jù)及其他生物信息學(xué)工具
        2.1.3 PME基因家族成員的鑒定
        2.1.4 基因表達(dá)數(shù)據(jù)獲取及處理
        2.1.5 總RNA的提取及cDNA合成
        2.1.6 白菜PME基因家族qRT-PCR分析
        2.1.7 花發(fā)育相關(guān)PME啟動子序列獲取及分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 白菜等九種植物的PME基因家族成員都較多
        2.2.2 白菜等九種植物709個PME可分為五類
        2.2.3 PME家族基因的表達(dá)分析
        2.2.4 白菜PME基因表達(dá)驗證
        2.2.5 花序特異或優(yōu)勢表達(dá)的PME分析
    2.3 討論
        2.3.1 在高等植物中PME基因家族成員都比較多
        2.3.2 眾多PME基因參與花序的發(fā)育
        2.3.3 不同植物參與花序發(fā)育的PME在序列上高度保守
3 白菜和擬南芥花粉發(fā)育相關(guān)的四個PME基因序列與表達(dá)分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 植物材料、載體、菌種與主要試劑
        3.1.2 DNA、RNA的提取與cDNA的合成
        3.1.3 DNA和CDS的克隆
        3.1.4 核酸和蛋白序列分析
        3.1.5 實時熒光定量分析(qRT-PCR)
        3.1.6 啟動子融合表達(dá)
            3.1.6.1 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
            3.1.6.2 擬南芥浸花轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選
            3.1.6.3 啟動子融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因擬南芥的觀察
        3.1.7 亞細(xì)胞定位
            3.1.7.1 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
            3.1.7.2 洋蔥表皮瞬時轉(zhuǎn)化
            3.1.7.3 亞細(xì)胞定位觀察
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37的啟動子、核酸和蛋白質(zhì)序列分析
        3.2.2 BcPME37a、BcPME37b、BcPME37c和AtPME37在花粉中優(yōu)勢或特異表達(dá)
        3.2.3 表明BcPME37c在花發(fā)育晚期表達(dá)量較高
        3.2.4 BcPME37c的編碼蛋白定位于細(xì)胞壁
    3.3 討論
        3.3.1 BcPME37a、BcPME37b和AtPME37的功能可能相似
        3.3.2 BcPME37c可能參與成熟花粉的發(fā)育和花粉萌發(fā)等過程
        3.3.3 BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c的功能可能有分化
4 白菜CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立
    4.1 材料與方法
        4.1.1 植物材料、載體、菌株、主要試劑及常用培養(yǎng)基配方
        4.1.2 sgRNA的設(shè)計、合成及退火
        4.1.3 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        4.1.4 sgRNA-Cas9-121載體對菜心的遺傳轉(zhuǎn)化
        4.1.5 基因組DNA的提取
        4.1.6 陽性芽及突變類型鑒定
        4.1.7 T-DNA插入片段檢測
        4.1.8 脫靶檢測
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 克隆得到Bra003491、Bra007665和Bra014410基因DNA序列和CDS
        4.2.2 構(gòu)建了單靶點載體并轉(zhuǎn)化菜心得到突變體
        4.2.3 構(gòu)建了多靶點載體并轉(zhuǎn)化菜心得到突變體
        4.2.4 CRISPR/Cas9引起的白菜基因突變可以穩(wěn)定地遺傳到T_1代和T_2代
        4.2.5 得到了不含T-DNA的Bra003491突變體
        4.2.6 在白菜突變體中未檢測到脫靶效應(yīng)
    4.3 討論
        4.3.1 高效菜心CRISPR/Cas9體系的建立
        4.3.2 多靶點載體在菜心中實現(xiàn)大片段敲除
        4.3.3 多靶點載體在菜心中實現(xiàn)兩個基因的同時編輯
        4.3.4 少數(shù)堿基的插入和缺失突變造成蛋白質(zhì)移碼突變或者翻譯提早結(jié)束
        4.3.5 T_0代的突變可以穩(wěn)定遺傳給后代
        4.3.6 通過自交可以得到不含T-DNA的突變體
        4.3.7 三條sgRNA在菜心中沒有脫靶
5 BcPME37c在白菜花粉發(fā)育中的功能鑒定
    5.1 材料與方法
        5.1.1 植物材料和主要試劑耗材
        5.1.2 敲除突變體的形態(tài)學(xué)觀察
        5.1.3 花粉活力檢測
        5.1.4 花粉直徑測量
        5.1.5 花粉苯胺藍(lán)染色
        5.1.6 花粉DAPI染色
        5.1.7 花粉形態(tài)掃描電鏡觀察
        5.1.8 花粉切片透射電鏡觀察
        5.1.9 結(jié)籽率統(tǒng)計
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 bcpme37c營養(yǎng)生長及四輪花器官的形態(tài)均正常
        5.2.2 bcpme37c部分花粉吸脹后直徑明顯增大
        5.2.3 BcPME37c突變后不影響花粉核的分裂及胼胝質(zhì)的降解
        5.2.4 bcpme37c部分花粉形態(tài)異常
        5.2.5 bcpme37c成熟花粉內(nèi)壁異常加厚
        5.2.6 bcpme37c結(jié)籽正常
    5.3 討論
        5.3.1 BcPME37c可能通過調(diào)控內(nèi)壁HG的甲酯化程度來影響內(nèi)壁的建構(gòu)
        5.3.2 bcpme37c表型不太明顯可能是基因功能冗余導(dǎo)致
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 附表和附圖
    附錄2 常用試劑和培養(yǎng)基配方
在讀期間發(fā)表的論文



本文編號：3639530