遺傳修飾豬在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。通過遺傳修飾,人們可以加速改良豬的生長性狀、抗病性能和肉質(zhì)品質(zhì)。另一方面,遺傳修飾豬可以作為人類疾病模型和異種器官移植供體,為人類健康做出貢獻(xiàn)。CRISPR/Cas9是最新開發(fā)的一種基因組編輯工具,在gRNA的指導(dǎo)下,Cas9核酸內(nèi)切酶在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。經(jīng)過細(xì)胞自身不同的修復(fù)機(jī)制,基因組會產(chǎn)生多種突變模式。由于編輯效率高、構(gòu)建簡單等優(yōu)勢,CRISPR/Cas9已經(jīng)成為最受歡迎的基因編輯技術(shù),目前已成功應(yīng)用于線蟲、小鼠、果蠅、羊等多個物種。MSTN是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的成員之一,主要作用是負(fù)向調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育。MSTN基因缺陷小鼠出現(xiàn)由肌纖維增生和肥大引起的肌肉量顯著增加,攜帶MSTN基因自然突變的牛也呈現(xiàn)以肌肉量增加為特征的雙肌表型。這些研究表明MSTN可以作為提高豬生長表現(xiàn)的重要候選基因,對豬MSTN基因進(jìn)行遺傳修飾有望培育出高瘦肉率的新品種。本實(shí)驗著重研究了CRISPR/Cas9在豬胚胎成纖維細(xì)胞中的基因編輯,以此為基礎(chǔ),構(gòu)建了靈活高效的豬基因組編輯平臺。首先,通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù)及介質(zhì),大幅度將豬胚胎成纖維細(xì)... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

第一只克隆羊-“多莉”[38]

第 2 章 基因編輯研究進(jìn)展點(diǎn)的 DNA 雙鏈斷裂可以激活細(xì)胞內(nèi)部的修復(fù)機(jī)制，bikova 等初步證明以鋅指蛋白（ZFP）為基礎(chǔ)構(gòu)建的）[64, 65]。研究還發(fā)現(xiàn)，在缺少同源修復(fù)模板的情況下結(jié)合（NHEJ）的修復(fù)方式產(chǎn)生隨機(jī)的堿基缺失或插入斷裂誘導(dǎo)的 HDR 和 NHEJ 修復(fù)機(jī)制可以對基因組進(jìn)代的到來。特定位點(diǎn)引入 DNA 雙鏈斷裂，多種定制化的核酸內(nèi)切核酸酶（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TAISPR）及其相關(guān)蛋白 9（CRISPR-associated protein 9，

圖 3 MSTN 缺陷小鼠的表型[139]Figure 3 Phenotype of MSTN-null mice比利時藍(lán)牛和皮埃蒙特牛是著名的雙肌牛品種，其前肢和臀部的肌肉特別發(fā)達(dá)，具見的明顯肌肉突起以及增加的肌肉產(chǎn)量�；� MSTN 對肌肉生長的抑制作用，研測了雙肌牛品種的 MSTN 基因。皮埃蒙特牛 MSTN 基因第三外顯子出現(xiàn)了一個誤導(dǎo)致第 313 位保守的半胱氨酸變?yōu)槔野彼�，破壞了蛋白的正確構(gòu)象[161, 162]。比利時MSTN 基因在第三外顯子出現(xiàn)了 11 個堿基的缺失，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，具有生C末端缺失102個氨基酸[161, 163]。此外，在其他多個雙肌牛品種中也發(fā)現(xiàn)了大量的M突變，這些研究表明 MSTN 突變是導(dǎo)致部分雙肌牛的肌肉肥大的原因。研究人員在其他物種同樣發(fā)現(xiàn)了 MSTN 的自然突變。2004 年，Schuelke 首次報道的 MSTN 基因突變，一名兒童 MSTN 基因的非編碼區(qū)出現(xiàn)了單堿基的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而[164]


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