基因組印記（genomic imprinting）是指由于親本染色體差異表觀遺傳修飾（epigenetic modification）所導(dǎo)致的單等位基因表達。這些親本來源特異性的單等位表達基因稱為印記基因（imprinting gene）。在哺乳動物中,印記基因在胎兒生長發(fā)育、胎盤功能和出生后行為的調(diào)控中都起著重要的作用。近年來,隨著對印記基因的廣泛研究和深入理解,發(fā)現(xiàn)它對動物重要的經(jīng)濟性狀和繁育至關(guān)重要。印記基因的表達紊亂是體細胞核移植動物（somatic cell nuclear transfer,SCNT）出生死亡和發(fā)育異常的重要因素。然而,大多數(shù)印記基因的發(fā)現(xiàn)和研究都集中在人類和小鼠種,而在家畜上的研究還很少。本研究以牛DLK1-DIO3印記區(qū)域的LINC24065基因和GPR1-ZDBF2區(qū)域為研究對象,分析其在新生和成年階段牛組織及胎盤中的印記和甲基化狀態(tài),同時也對新生死亡體細胞核移植牛組織進行了檢測,得到以下研究結(jié)果:1.利用RACE及RT-PCR技術(shù),在牛DLK1-DIO3的印記域基因MEG8和MEG9之間,得到了一個具有6個可變剪接體（V1-V6）的長基因間非編碼RN... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學河北省

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

表觀遺傳調(diào)控水平[5]

7復(fù)合物影響附近基因的表達。即lncRNA的表達常常與附近基因的表達相關(guān)[8,66]。1.3.2長非編碼RNA的調(diào)控模式根據(jù)lncRNA調(diào)控基因表達的模式，lncRNA可分為四種主要類型（圖1-2）[67]，即信號（signal）、誘餌（decoys）、向?qū)В╣uides）和腳手架（scaffolds），這些模式之間并不相互排斥，它們可以共同作用[68]。具有與信號或誘餌相關(guān)功能的lncRNA分別參與基因的激活或抑制。作為引導(dǎo)者的lncRNA會招募染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)基因，通過順式或反式的方式來調(diào)控靶基因的表達。作為支架的lncRNAs可以招募多個蛋白質(zhì)來組裝核糖核酸復(fù)合物，這些復(fù)合物通常作用于染色質(zhì)和/或調(diào)節(jié)組蛋白標記。許多l(xiāng)ncRNAs具備一個以上的特征，因此具有綜合功能，如下圖1-2。圖1-2LncRNAs在表觀遺傳學中的調(diào)控[67]A:IncRNA可能以蛋白質(zhì)復(fù)合物為支架，以染色質(zhì)重塑組分為誘餌，以直接重構(gòu)者為導(dǎo)向。B:LncRNA引導(dǎo)表觀遺傳修飾改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、組蛋白甲基化或乙酰化水平以及DNA甲基化水平。Figure1-2TheregulationoflncRNAsinepigenetics（A）LncRNAmayrecruitproteincomplexesasscaffold,deceivechromatin-remodelingcomponentsasdecoy,anddirectremodelersasguide.（B）LncRNAguidesepigeneticmodifierstochangethechromatinstructure,histonemethylationoracetylationlevel,andDNAmethylationlevel.1.3.3長非編碼RNA的鑒定方法目前，lncRNAs鑒定和功能注釋主要采取多種實驗方法的結(jié)合：（1）使用RNA-seq和ChIP-seq發(fā)現(xiàn)新的非編碼轉(zhuǎn)錄本；（2）利用生物信息分析對轉(zhuǎn)錄區(qū)范圍，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量進行注釋；（3）在不同類型細胞，組織類型和條件下對lncRNAs進行定量；（4）共表達或協(xié)同調(diào)控研究，在細胞株系或異種移植物中，通過功能缺失和獲得實

20Water混勻。（2）65℃孵育5min，冰浴2min（3）將1μLgDNARemover，10μL2×ESReactionMix，1μLRTEnzymeMix混合物，加入（2）的反應(yīng)液中。（4）42℃反應(yīng)30min，85℃5s將酶（EasyScriptRT/RI與gDNARmover）滅活。（5）-20℃貯存?zhèn)溆谩?.2.5LINC24065cDNA的克隆2.2.5.1EST序列的獲得利用UCSC數(shù)據(jù)庫，在牛21號染色體的DLK1-DIO3印記域內(nèi)，基因MEG8和MEG9間發(fā)現(xiàn)了兩個可剪接的ESTs簇（ESTs1，ESTs2）。ESTs1包括4個EST序列：DY096394，DY196469，CB463975和CR852162。ESTs2包括6個EST序列：DN517831，CB431395，CB849952，AU097863和EE355346。每簇ESTs的各序列相互之間有交疊（圖2-1）。ESTs1和ESTs2之間沒有交疊，且在位置上相鄰。今年來在鼠中，meg8和meg9之間已經(jīng)鑒定了幾個lncRNAs，因此推測它們可能是同一基因的部分序列；并且通過這些EST序列間的交疊關(guān)系，可以認為該基因應(yīng)該還有可變剪接體存在。圖2-1基因MEG8-MEG9間的ESTsFigure2-1ESTssitebetweenMEG8andMEG92.2.5.2RACE引物的設(shè)計選取ESTs1中的交疊序列區(qū)，利用Oligo7軟件設(shè)計RACE引物，其中3"端引物為嵌套引物。5"RACE引物（RACE5"）和3"RACE引物（RACE3"）位于序列DY196469的第2個外顯子，3"端嵌套引物RACE3"-1位于DY196469的第7個外顯子上。2.2.5.3LINC24065序列的獲得（1）5"/3"RACEFirst-StrandcDNA的合成以成年牛大腦組織做為RACE模板，依照SMARTerRACE5"/3"Kit的方法步驟

【參考文獻】：
期刊論文
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