基因重組是可用于基因克隆、基因修飾的一種分子生物學(xué)技術(shù),操作簡(jiǎn)單而高效,對(duì)于基因表征的研究具有重要的價(jià)值和意義。本論文主要研究谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的基因敲除和重組工程介導(dǎo)的點(diǎn)突變。谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032及其衍生菌株是工業(yè)上用于生產(chǎn)氨基酸的重要生產(chǎn)菌株。染色體基因敲除的研究將有助于研究基因表征和蛋白質(zhì)功能。為克服目前的方法效率低的問題,探索比較各系統(tǒng)的敲除效率,以期建立一個(gè)適用于谷氨酸棒狀桿菌的高效簡(jiǎn)便基因編輯方法。首先,通過調(diào)節(jié)I-SceI基因之前的核糖體結(jié)合位點(diǎn)獲得更高水平的基因表達(dá)。盡管打靶DNA片段通過重組工程成功替代了抗性基因,但第二步抗性基因的去除未能通過短同源臂介導(dǎo)的重組而實(shí)現(xiàn)。將同源臂延伸至1 kb后,由自殺載體介導(dǎo)的基因敲除成功實(shí)現(xiàn)了無痕敲除。高敲除效率顯示了此法具有作為有效基因敲除策略的強(qiáng)大潛力。通過構(gòu)建Cre誘導(dǎo)型表達(dá)載體和crtI2基因缺失載體,初步測(cè)試了另一種基因敲除系統(tǒng)——Cre/loxP介導(dǎo)的基因敲除系統(tǒng)。最后,構(gòu)建了 IPTG誘導(dǎo)的recT-cas9基因表達(dá)載體,將用于單鏈DNA輔助的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的染色體基因編輯。本... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?Ｗ１菌體Ｒｅｄ介導(dǎo)的同源重組過程??人噬菌體Ｒｅｄ介導(dǎo)的同源重組過程［４］（圖１）

植物細(xì)胞中的遺傳操作。Ａｌｂｅｒｔ等［３９］報(bào)道了一系列可被識(shí)別重組的突變／ｏｘＰ位??點(diǎn)，為Ｃｒｅ／／ｏｘＰ系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用提供了保證。??利用Ｃｒｅ／ｆｃｘＰ系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的一般方法如圖２所示??ｐ＃遙粒矗歟??ｐＣＲＡ４ｌ９??Ｕ?ｉａｃＺ??［＞Ｃ?ＬＥ?ｍｕｔｍｔ?ｋｉｘＴｉ?ＲＦ；?ｎｍｉｔｍｉ?�。恚叮�?＞＜］???ｉ?ｉ?？／＿??Ｇｅｎｏｒｎｇ??ＧＲ１?１＾．???????｜＾｜?ＧＲ２??Ｔａｒｇｅｔ?ｒｅｇｉｃｅｉｆ?１０?－?５６?ｋｂ）??——Ｃ＝＾＜］［＾ｒ｜Ｊ＝＝］???Ｖ???????Ｊ??Ｈ．?ｃｏｌｉ?＾??ｅ＇ｉ?＾?Ｃｒｅ?ｒｃｅ＾ｓｉ＇ｓｂｉｎ＾ｓｃ－ｍｅｄｉａｉｅｄ?ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ??ｋ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ???１????Ｃｏｒｙ?Ｗｏｒｍ?ｆ．，??圖２?Ｃｒｅ／ｔｏｃＰ介導(dǎo)的谷氨酸棒狀桿菌大片段敲除示意圖??為卡那霉素抗性基因；辦ｒ?yàn)榇笥^霉素抗性基因；ｂｃＺ為半乳糖酶編碼基因；ＧＲ１和??ＧＲ２為ＰＣＲ擴(kuò)增獲得的谷氨酸棒狀桿菌短片段基因并通過重組整合入質(zhì)粒中。黑色箭頭（Ｐ１??和Ｐ２）為ＰＣＲ引物??在構(gòu)建三個(gè)不同抗性的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)入Ｃｒｅ表達(dá)質(zhì)粒，即將／ｏｘＰ位點(diǎn)插入目??的基因片段的兩端，并驗(yàn)證兩／ｏｘＰ位點(diǎn)為同方向；完成重組后，設(shè)法去除質(zhì)粒??或留在菌體內(nèi)。但利用Ｃｒｅ／／〇ｘＰ系統(tǒng)完成一次敲除后，基因組上會(huì)殘留一個(gè)／ｏｘＰ??位點(diǎn)而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，不利于在同一菌株中進(jìn)行二次敲除。后來發(fā)現(xiàn)了多種??變異丨ｏｘ位點(diǎn)

圖３?ＣＲＩＳＰＲ的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)??ＣＲＩＳＰＲ由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列（ｒｅｐｅａｔｓ）與長度相似的間隔??序列（ｓｐａｃｅｒｓ）間隔排列組成，如圖３所示。存在于ＣＲＩＳＰＲ位點(diǎn)附近一系列??ＣＲＩＳＰＲ?相關(guān)基因（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ，?Ｃａｓ?ｇｅｎｅｓ），是?ＣＲＩＳＰＲ?免疫防御途??徑中的基本組成成分，往往與ＣＲＩＳＰＲ位點(diǎn)的重復(fù)序列相連。ｃｍ基因是一類較??大的多態(tài)性基因家族，編碼的蛋白質(zhì)具有與核酸相關(guān)的功能域以及與核酸酶、聚??合酶、解旋酶等結(jié)合的活性，Ｃａｓ蛋白通過位點(diǎn)特異性的切割將入侵ＤＮＡ切斷。??不同的基因在宿主應(yīng)對(duì)外源ＤＮＡ入侵時(shí)發(fā)揮著不同的作用；且在不同的物??種中，ｏｗ基因的種類也各不相同，表達(dá)出多種同源但功能不相關(guān)的Ｃａｓ蛋白［５１１??ＣＲＩＳＰＲ位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列上游是ＣＲＩＳＰＲ前導(dǎo)序列（Ｌｅａｄｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ），啟動(dòng)??ＣＲＩＳＰＲ序列的轉(zhuǎn)錄［５２］，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼ＲＮＡ被命名為ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡｓ??（ｃｒＲＮＡｓ）［５３］

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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