病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是一種快速、高效、便捷的基因功能驗(yàn)證的反向遺傳學(xué)手段。煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）介導(dǎo)的VIGS技術(shù)可以在多種植物上實(shí)現(xiàn)基因沉默,但其應(yīng)用卻因由侵染操作引起的植物損傷與沉默效率低下受到限制。本研究以大豆（Glycine max）為材料,通過對農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染方法進(jìn)行改良,使TRV從植物根部侵染,隨病毒在植物體內(nèi)的運(yùn)輸,實(shí)現(xiàn)對植物內(nèi)源基因的系統(tǒng)性沉默。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,將攜帶VIGS載體的農(nóng)桿菌使用本方法從根部侵染大豆后,可以使同一處理批次內(nèi)近全部植株產(chǎn)生有效基因沉默,基因沉默效率均在67%以上,最高達(dá)到98%;對處理植株不同位置的葉片進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)第1至第3輪三出復(fù)葉均有較為理想的沉默效果,其中第1輪三出復(fù)葉的沉默效率最高;本研究有效沉默的基因包括非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（non-specific lipid-transfer protein, LTP）、病程相關(guān)蛋白1 （pathogenesis-related pro... 

【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,28(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

待沉默基因mRNA中VIGS的靶向位置

本課題組前期研究表明，TRV不影響大豆與SMV的互作方式(劉曉彬等,2015)。為了篩選大豆與SMV互作過程中影響病毒運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵基因，需要以接種SMV的上位葉作為實(shí)驗(yàn)材料。因此，檢測TRV-VIGS對植株不同位置的葉片是否可以有效沉默目的基因是此類實(shí)驗(yàn)開展的前提。q RT-PCR分析結(jié)果表明(圖3)，在沉默XTH的植株中，第1輪三出復(fù)葉沉默效率最高可達(dá)89%(L1-#13)，最低為67%(L1-#11)，平均沉默效率為76%；第2輪三出復(fù)葉沉默效率最高可達(dá)76%(L2-#13)，最低為55%(L2-#11)，平均沉默效率為66%；第3輪三出復(fù)葉沉默效率最高可達(dá)63%(L3-#12)，最低為42%(L3-#10)，平均沉默效率為50%(圖3A)。在沉默CYSTM的植株中，沉默效率在第1輪三出復(fù)葉中平均為90%，第2輪三出復(fù)葉平均為86%，第3輪三出復(fù)葉平均為76%(圖3B)。這一結(jié)果表明，本方法可以在同一植株的不同葉片間達(dá)到較好的基因沉默效果，并且第1輪三出復(fù)葉的沉默效率要優(yōu)于第2和第3輪三出復(fù)葉，這為后續(xù)進(jìn)一步研究病毒長距離運(yùn)輸及系統(tǒng)獲得抗性(systematic acquired resistance,SAR)等涉及植物性狀長期觀察的實(shí)驗(yàn)提供了良好的實(shí)驗(yàn)操作體系。2.4 q RT-PCR檢測不同基因的沉默效率

VIGS技術(shù)是一項(xiàng)便捷、高效的反向遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，與RNAi相比，利用該方法進(jìn)行基因功能分析時(shí)避免了遺傳轉(zhuǎn)化操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)。在以往的報(bào)道中，VIGS病毒的接種方法往往為莖部注射(劉曉彬等,2015)，葉片注射(Juvale et al.,2012)，或直接在葉片上涂抹體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA(Gu et al.,2020)。這些方法通常會(huì)造成植物組織的損傷，且操作繁瑣，不利于大量制備沉默目的基因的植株材料。本研究對TRV-VIGS的侵染方法進(jìn)行了改良，使其可以在短時(shí)間獲得大量的基因沉默植物材料，并從個(gè)體均一性、組織分布有效性和基因適用性共3個(gè)層面對改良后VIGS實(shí)驗(yàn)操作方法的效果進(jìn)行了檢驗(yàn)。本研究采用"澆灌法"接種VIGS病毒，其實(shí)質(zhì)是利用根癌農(nóng)桿菌侵染植物根系的天然特性。在攜帶有p TRV1和p TRV2的農(nóng)桿菌混合物侵染植物根系后，TRV病毒在侵染的細(xì)胞內(nèi)完成組裝，并進(jìn)入韌皮部進(jìn)行長距離運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染。然而不可否認(rèn)的是，在培養(yǎng)介質(zhì)中澆灌農(nóng)桿菌很難使每株植物都受到相同水平的侵染，因此植株體內(nèi)TRV病毒的水平，以及基因的沉默效率很難保持一致。為了克服這些缺陷，本研究在侵染緩沖液中加入了L-Cys和表面活性劑Silwet L-77，以提高農(nóng)桿菌溶液的擴(kuò)散均勻程度以及農(nóng)桿菌的侵染效率。此外，在結(jié)果圖2和圖3中XTH和CYSTM的沉默效率有一定差別，這可能是由不同批次間農(nóng)桿菌活性的區(qū)別導(dǎo)致的。本研究還發(fā)現(xiàn)，TRV可以誘導(dǎo)植株發(fā)生系統(tǒng)性基因沉默，其中XTH基因的平均沉默效率在第1輪三出復(fù)葉為76%，第2輪三出復(fù)葉為66%，第3輪三出復(fù)葉為50%(圖3A);CYSTM基因的平均沉默效率在第1輪三出復(fù)葉為90%，第2輪三出復(fù)葉為86%，第3輪三出復(fù)葉為76%(圖3B)。本研究觀察到，TRV-VIGS的沉默效率在不同位置的葉片中是不同的，這可能是由于TRV病毒在植物體內(nèi)的不均勻分布導(dǎo)致的。本研究還檢測了TRV-VIGS對LTP、PR1、TLP和DHN基因的沉默效率。綠豆(Vigna radiata) LTP具有抑制如茄病鐮刀菌(Fusarium solani)等真菌和金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等細(xì)菌的活性(Wang et al.,2004);PR1參與水楊酸調(diào)控的免疫反應(yīng)(Tomoya et al.,1998)，胡椒(Piper nigrum) PR1基因在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)TMV侵染(Sujon et al.,2005);TLP在啤酒花(Humulus lupulus)受白粉菌(Podospheara macularis)侵染后誘導(dǎo)表達(dá)(Kappagantu et al.,2017)，其翻譯產(chǎn)物參與多種非生物脅迫的響應(yīng)過程(劉潮等,2018)；大麥(Hordeum vulgare) DHN在寒冷和干旱處理后表達(dá)升高(Zhu et al.,2000);XTHs主要分布于細(xì)胞壁(Montserrat et al.,2006)，蘋果(Malus domestica) XTH響應(yīng)擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)的侵染(Mu?oz-Bertomeu,Lorences,2014);CYSTMs廣泛存在于真核細(xì)胞中(Venancio Aravid,2010)，擬南芥CYSTM響應(yīng)包括鹽脅迫在內(nèi)的一系列環(huán)境刺激(Xu et al.,2018)。上述這些基因在大豆內(nèi)的同源物均響應(yīng)SMV的侵染，可能參與大豆對SMV的防衛(wèi)反應(yīng)，因此成為本研究檢測的目標(biāo)基因。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，EF1b基因在病毒侵染前后的表達(dá)水平具有良好的穩(wěn)定性(Ma et al.,2013)，因此選擇EF1b作為內(nèi)參基因檢測目的基因的相對表達(dá)量。本研究在TRV-VIGS沉默的基因適用性檢測中，發(fā)現(xiàn)不同的基因可達(dá)到的沉默效率有所不同。其中XTH基因的平均沉默效率最高(93%)(圖2),TLP基因的平均沉默效率最低(44%)(圖4)，說明不同基因的沉默效率存在差異�；虻某聊适芏嘀匾蛩氐挠绊�，除了上面提及的農(nóng)桿菌活性和TRV在體內(nèi)的分布影響外，基因沉默區(qū)段的選擇也是主要的影響因素之一。Ding等(2018)的研究表明，在BMV-VIGS載體中插入的目的基因片段越長，基因的沉默效率越高。高陽等(2011)的研究發(fā)現(xiàn)，在TNV-VIGS載體中以反向重復(fù)的形式插入基因的特異性片段，可以獲得比單方向插入更好的沉默效果。Ge等(2016)使用Sfold工具對不同特異性區(qū)段的VIGS效率進(jìn)行評估和預(yù)測，發(fā)現(xiàn)靶向m RNA的不同位置所產(chǎn)生的沉默效率有較大區(qū)別。因此在本研究中不同基因沉默效率的差異也可能與沉默區(qū)段的設(shè)計(jì)有關(guān)。雖然這種推斷仍需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來證實(shí)，但是考慮到選擇不同的區(qū)段構(gòu)建VIGS載體可能是獲得相對高效沉默植株的最廉價(jià)方法，因此建議在考慮基因沉默特異性的前提下選擇同一基因的不同區(qū)段，以增加后續(xù)工作的說服力。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3560356