本文關(guān)鍵詞：致倦庫蚊氣味受體基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：致倦庫蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū),也是我國南方地區(qū)最常見的蚊種之一,是我國淋巴絲蟲病和流行性乙型腦炎的重要傳播媒介。致倦庫蚊求偶、尋找蜜源、植物汁液及宿主進(jìn)行吸血,都需要通過嗅覺系統(tǒng)中的氣味受體(odorant receptor,OR)結(jié)合不同宿主氣味化合物,向下游傳遞嗅覺信號,最終完成對宿主的定位。本研究通過測定不同ORs在致倦庫蚊各個生長階段及不同吸血情況蚊蟲頭部的表達(dá),結(jié)合RNAi技術(shù)對ORs功能進(jìn)行驗(yàn)證；另一方面比較尖音庫蚊復(fù)合組中致倦庫蚊、騷擾庫蚊和淡色庫蚊(三亞種擁有相似的基因組,形態(tài)特征不容易區(qū)分,但生理行為方面存在明顯的差異。致倦庫蚊與淡色庫蚊具有兼吸人、獸、鳥等多種宿主血液的復(fù)雜嗜血習(xí)性,而騷擾庫蚊雌蚊不需要吸血也可完成第一次產(chǎn)卵)頭部ORs的差異性來推測ORs的功能。從兩個方向?qū)χ戮霂煳脷馕妒荏w基因功能進(jìn)行研究,從而為阻斷或者干擾媒介昆蟲與宿主之間的信號傳導(dǎo)達(dá)到防治媒介昆蟲的新策略提供理論依據(jù),也可為開發(fā)新的驅(qū)避劑劑或引誘劑提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1、利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定11個ORs在致倦庫蚊不同生長階段的表達(dá),結(jié)果顯示CquiOR117與其它10個ORs相比在致倦庫蚊各個生長階段表達(dá)量最高；CquiOR54在卵到蛹以及雄蚊羽化后一周內(nèi)表達(dá)量最低；CquiOR78在雄蚊中特異性表達(dá)。同時測定11個ORs在致倦庫蚊不同吸血情況頭部的表達(dá),結(jié)果顯示CquiOR15、 CquiOR54、CquiOR71和CquiOR118在雌蚊飽血與未吸血頭部之間的表達(dá)存在顯著性差異,說明這4個ORs可能與致倦庫蚊的吸血性有一定的關(guān)系。2、利用RNAi技術(shù)對CquiOR117進(jìn)行干擾,結(jié)果顯示注射CquiOR117dsRNA后1-6天其表達(dá)量與對照相比分別下降了19.96%、71.51%、72.99%、70.30%、86.36%、85.41%；結(jié)合蚊蟲吸血實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),注射后1-6天蚊蟲飽血率與對照相比分別下降52.30%、45.80%、43.32%、21.45%、4.35%、10.23%,由此可以推測CquiOR117與致倦庫蚊的吸血行為有關(guān)。3、分別對致倦庫蚊、騷擾庫蚊和淡色庫蚊頭部ORs的全長進(jìn)行克隆,結(jié)果得到19個ORs全長序列,通過氨基酸序列比較顯示,它們與VectorBase上公布的南非約翰內(nèi)斯堡株(JHB)雌蚊ORs相比都存在非同義突變,其中最少的CquiOR121有3處,最多的CquiOR11突變位點(diǎn)達(dá)到75處。同時對所測定氣味受體的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示CquiOR04、CquiOR05、CquiOR06只有騷擾庫蚊在其跨膜區(qū)出現(xiàn)了突變,而在CquiOR42和CquiOR65跨膜區(qū)域卻只有騷擾庫蚊沒出現(xiàn)突變。從另一個方向說明上述5個ORs可能參與了致倦庫蚊和淡色庫蚊不同于騷擾庫蚊的一些生理行為,如致倦與淡色的復(fù)雜嗜血性。
【關(guān)鍵詞】：尖音庫蚊復(fù)合組 致倦庫蚊 氣味受體 熒光定量PCR RNAi
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R184.31
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 1 文章綜述10-14
• 1.1 蚊蟲OR研究進(jìn)展10-12
• 1.1.1 蚊蟲嗅覺系統(tǒng)10
• 1.1.2 蚊蟲OR特點(diǎn)及特征10
• 1.1.3 不同蚊種OR研究10-12
• 1.2 RNAI技術(shù)在蚊蟲中研究與應(yīng)用12-14
• 1.2.1 RNAi背景12
• 1.2.2 RNAi作用分子機(jī)制12-13
• 1.2.3 RNAi在蚊蟲基因功能研究中的應(yīng)用13-14
• 2 不同OR在致倦庫蚊發(fā)育階段的表達(dá)14-29
• 2.1 材料14
• 2.1.1 供試蚊種14
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備14
• 2.1.3 主要試劑14
• 2.2 方法14-19
• 2.2.1 不同生長階段蚊蟲及蚊蟲頭部收集14-15
• 2.2.2 不同生長階段蚊蟲及蚊蟲頭部RNA提取15
• 2.2.3 cDNA獲得15-16
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增氣味受體(ORs)基因16
• 2.2.5 電泳與測序16
• 2.2.6 PCR產(chǎn)物的純化16-17
• 2.2.7 LB培養(yǎng)基的配制17-18
• 2.2.8 連接及轉(zhuǎn)化反應(yīng)18
• 2.2.9 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定18
• 2.2.10 提取重組質(zhì)粒18
• 2.2.11 目標(biāo)ORs基因及內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建18-19
• 2.2.12 不同ORs在致倦庫蚊不同生長階段實(shí)時熒光定量PCR分析19
• 2.3 結(jié)果19-27
• 2.3.1 氣味受體(ORs)基因和內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立19
• 2.3.2 不同ORs基因在致倦庫蚊不同生長階段的表達(dá)分析19-20
• 2.3.3 不同ORs基因在致倦庫蚊同一生長階段的表達(dá)比較20-21
• 2.3.4 不同ORs基因在吸血情況不同蚊蟲頭部的表達(dá)分析21-27
• 2.4 討論與分析27-29
• 3 致倦庫蚊CQUIOR117的功能驗(yàn)證29-42
• 3.1 材料29
• 3.1.1 供試蚊種29
• 3.1.2 主要儀器29
• 3.1.3 主要試劑29
• 3.2 方法29-33
• 3.2.1 模板cDNA獲得29-30
• 3.2.2 體外合成dsRNA30-31
• 3.2.3 蚊蟲的微量注射31-32
• 3.2.4 微量注射dsRNA32
• 3.2.5 注射RNA后CquiOR117表達(dá)情況分析32
• 3.2.6 蚊蟲嗜血行為實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.3 結(jié)果33-39
• 3.3.1 體外dsRNA合成情況33
• 3.3.2 蚊蟲不同麻醉方式效果33-34
• 3.3.3 注射量及部位選擇34-35
• 3.3.4 RT-PCR檢測注射RNA后蚊蟲的干擾率35-36
• 3.3.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測CquiOR117干擾后表達(dá)情況36-37
• 3.3.6 蚊蟲嗜血行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析37-39
• 3.4 討論與分析39-42
• 4 尖音庫蚊復(fù)合組中氣味受體基因克隆與比較42-70
• 4.1 材料42
• 4.1.1 供試蚊蟲42
• 4.1.2 主要儀器42
• 4.1.3 主要試劑42
• 4.2 方法42-44
• 4.2.1 騷擾庫蚊、淡色庫蚊和致倦庫蚊頭部RNA的提取42-43
• 4.2.2 騷擾庫蚊、淡色庫蚊和致倦庫蚊頭部氣味受體基因(ORs)的擴(kuò)增43
• 4.2.3 PCR產(chǎn)物的回收與純化43-44
• 4.2.4 連接與轉(zhuǎn)化44
• 4.2.5 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定44
• 4.2.6 尖音庫蚊復(fù)合組氣味受體基因測序結(jié)果處理44
• 4.3 結(jié)果44-48
• 4.3.1 致倦庫蚊、騷擾庫蚊和淡色庫蚊氣味受體基因克隆結(jié)果44-45
• 4.3.2 尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲中亞種之間氣味受體進(jìn)化分析45
• 4.3.3 致倦庫蚊、騷擾庫蚊和淡色庫蚊氣味受體氨基酸突變位點(diǎn)分析45-47
• 4.3.4 尖音庫蚊復(fù)合氣味受體編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析47-48
• 4.4 討論與分析48-70
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 致謝74

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：285180