本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因克隆、原核表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是專性吸血的體外寄生蟲,在自然界中存在兩性生殖種群與孤雌生殖種群,可攜帶多種病原體而導(dǎo)致疾病,給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大危害。防御素(defensin)是一種抗微生物肽,在動(dòng)植物中廣泛存在,尤其在節(jié)肢動(dòng)物中,由于缺乏適應(yīng)性免疫反應(yīng),防御素在其先天免疫防御過程中發(fā)揮重要作用,可以有效對(duì)抗入侵的病原體。蜱作為專性吸血的特殊類群,同樣具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原體的侵襲。本研究以長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群為研究對(duì)象,利用Clontech建庫試劑盒和3’RACE的方法構(gòu)建cDNA文庫,分子克隆得到三條防御素基因,分別命名為Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。開放閱讀框大小分別為225bp、210bp和237bp,編碼氨基酸個(gè)數(shù)為74、69和78,成熟肽長(zhǎng)度分別為38、37和46,等電點(diǎn)分別為9.69、8.33和9.50。通過對(duì)Hp-defensin-1進(jìn)行原核表達(dá)及功能分析,結(jié)果表明,長(zhǎng)角血蜱Hp-defensin-1與邊緣革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,為75.68%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明,Hp-defensin-1基因序列與革蜱屬(森林革蜱KJ885301.1)親緣關(guān)系最近。熒光定量結(jié)果表明,Hp-defensin-1表達(dá)量在不同時(shí)期和不同組織存在顯著性差異(P0.05),大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌脅迫效果依次減弱。將Hp-defensin-1連入載體pET-32(a+),并轉(zhuǎn)入BL21中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白大小約23kDa,與預(yù)測(cè)大小一致。該多肽對(duì)革蘭氏陽性菌具有廣譜抗菌性,對(duì)部分革蘭氏陰性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。表達(dá)產(chǎn)物的抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,該多肽對(duì)ABTS·+和DPPH·自由基具有很強(qiáng)的清除能力,具有很強(qiáng)的抗氧化活性,但不存在溶血活性,因此對(duì)健康的人血細(xì)胞無傷害,為新型抗菌藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：長(zhǎng)角血蜱 孤雌生殖種群 防御素 原核表達(dá) 功能分析
【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q969.91
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-15
• 1.1 引言10
• 1.2 孤雌生殖種群簡(jiǎn)介10-11
• 1.3 抗菌肽簡(jiǎn)介11-12
• 1.4 昆蟲抗菌肽簡(jiǎn)介12-13
• 1.5 展望13-15
• 第二章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素基因的分子克隆15-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材15
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-21
• 2.2.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取15-16
• 2.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建16-18
• 2.2.2.1 建庫試劑盒構(gòu)建16-17
• 2.2.2.2 3’RACE反轉(zhuǎn)獲得cDNA17-18
• 2.2.3 抗菌肽基因的克隆18-21
• 2.2.4 抗菌肽基因的全長(zhǎng)的擴(kuò)增21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-28
• 2.3.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群總RNA的提取21-22
• 2.3.2 cDNA文庫的構(gòu)建22
• 2.3.3 抗菌肽基因的克隆22-24
• 2.3.4 抗菌肽基因的生物信息學(xué)分析24-28
• 2.3.4.1 基因序列分析24-26
• 2.3.4.2 Hp-defensin13 的系統(tǒng)發(fā)育樹分析26
• 2.3.4.3 蛋白序列分析26-28
• 2.4 討論28-30
• 2.4.1 抗菌肽基因的克隆28
• 2.4.2 抗菌肽的生物學(xué)分析28-30
• 第三章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素基因的原核表達(dá)30-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材30
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法30-38
• 3.2.1 構(gòu)建Defensin基因的原核表達(dá)載體30-33
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32(a＋)- defensin的誘導(dǎo)表達(dá)33-36
• 3.2.3 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定36-37
• 3.2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化37
• 3.2.5 重組蛋白的純化37-38
• 3.2.5.1 重組蛋白的大量收集37
• 3.2.5.2 裝柱準(zhǔn)備37-38
• 3.2.5.3 蛋白上清的親和層析38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-44
• 3.3.1 構(gòu)建Defensin基因的原核表達(dá)載體38-40
• 3.3.2 重組質(zhì)粒pET-32(a＋)- defensin的誘導(dǎo)表達(dá)40-41
• 3.3.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化41-44
• 3.3.4 重組蛋白的純化44
• 3.4 討論44-46
• 3.4.1 原核表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建44-45
• 3.4.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化與純化45-46
• 第四章 長(zhǎng)角血蜱孤雌種群防御素的功能分析46-61
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料46
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材46
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器46
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 4.2.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達(dá)量的分析46-48
• 4.2.1.1 防御素基因在不同時(shí)期不同組織中的表達(dá)量46-47
• 4.2.1.2 防御素基因不同菌脅迫下的表達(dá)量47-48
• 4.2.2 抑菌活性的分析48-50
• 4.2.3 抗氧化的分析50-51
• 4.2.4 溶血活性的分析51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-59
• 4.3.1 長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因表達(dá)量的分析51-54
• 4.3.2 抑菌活性的分析54-57
• 4.3.3 抗氧化的分析57-58
• 4.3.4 溶血活性的分析58-59
• 4.4 討論59-61
• 4.4.1 防御素基因的定量分析59-60
• 4.4.2 HP-defensin-1 重組蛋白的功能分析60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間取得的科研成果清單67

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1 田慶云;長(zhǎng)角血蜱季節(jié)消長(zhǎng)初步研究[J];昆蟲知識(shí);1988年05期

2 田占成;劉光遠(yuǎn);殷宏;羅建勛;謝俊仁;;長(zhǎng)角血蜱卵泡抑素相關(guān)蛋白的定性[J];生物工程學(xué)報(bào);2009年11期

3 劉敬澤,姜在階;實(shí)驗(yàn)室條件下長(zhǎng)角血蜱的生物學(xué)特性研究[J];昆蟲學(xué)報(bào);1998年03期

4 程遠(yuǎn)國,吳厚永,李德昌,李成文,趙彤言;長(zhǎng)角血蜱唾液腺中腺苷三磷酸雙磷酸酶的純化及其酶切機(jī)制[J];昆蟲學(xué)報(bào);2002年03期

5 李晉川;張有植;潘渠;殷建華;程曉剛;陳衛(wèi)中;楊川莉;;長(zhǎng)角血蜱產(chǎn)卵量分布的函數(shù)分析[J];四川動(dòng)物;2009年05期

6 李毅平,姜在階;激素對(duì)長(zhǎng)角血蜱生殖周期中生化成分的影響(英文)[J];北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1997年02期

7 李志芳;劉起勇;張衛(wèi)東;宋秀平;栗冬梅;馬懷雷;趙帆;孟鳳霞;任東升;靳建超;林杰;吳海霞;;長(zhǎng)角血蜱感染漢賽巴爾通體后血淋巴超氧化物歧化酶變化的初步研究[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年06期

8 高志華;楊小龍;劉敬澤;簡(jiǎn)恒;;長(zhǎng)角血蜱雌蜱感染嗜菌異小桿線蟲后血淋巴的變化[J];昆蟲學(xué)報(bào);2006年01期

9 程遠(yuǎn)國,吳厚永,李德昌;長(zhǎng)角血蜱唾液腺中膠原特異性血小板聚集抑制因子的純化及機(jī)制的研究[J];中國科學(xué)C輯:生命科學(xué);1999年06期

10 ;[J];;年期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝俊仁;劉光遠(yuǎn);田占成;龔真莉;劉建剛;張麗艷;;長(zhǎng)角血蜱成蜱免疫家兔模型的建立及對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 李鐵拴;王宗儀;高陽歷;李雙安;李三星;楊芷云;;河北省長(zhǎng)角血蜱的生物學(xué)特性及藥敏試驗(yàn)研究[A];中國動(dòng)物科學(xué)研究——中國動(dòng)物學(xué)會(huì)第十四屆會(huì)員代表大會(huì)及中國動(dòng)物學(xué)會(huì)65周年年會(huì)論文集[C];1999年

3 顏忠誠;;長(zhǎng)角血蜱雌蜱吸血后的體重與產(chǎn)卵和形態(tài)特征的關(guān)系[A];中國動(dòng)物科學(xué)研究——中國動(dòng)物學(xué)會(huì)第十四屆會(huì)員代表大會(huì)及中國動(dòng)物學(xué)會(huì)65周年年會(huì)論文集[C];1999年

4 張有植;李晉川;;西藏長(zhǎng)角血蜱產(chǎn)卵的觀察[A];走向21世紀(jì)的中國昆蟲學(xué)——中國昆蟲學(xué)會(huì)2000年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2000年

5 Li Chunhong;Zhou Yongzhi;Zhao Suhua;Liu Yi;Zhang Houshuang;Cao Jie;Zhou Jinlin;;長(zhǎng)角血蜱腸道細(xì)菌的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

6 田占成;劉光遠(yuǎn);殷宏;羅建勛;謝俊仁;;長(zhǎng)角血蜱卵泡抑素蛋白的初步定性[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 周金林;周勇志;龔海燕;曹杰;沈杰;;我國長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)特性的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

8 楊彩明;楊光友;吳開波;古小彬;郝桂英;賈小勇;張曉謙;劉德昊;;長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖蟲株各期蟲體的掃描電鏡觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

9 周金林;沈杰;周勇志;玄學(xué)南;藤崎幸藏;;長(zhǎng)角血蜱的一個(gè)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子(TGF-β)家族的調(diào)節(jié)分子的鑒定和它對(duì)蜱產(chǎn)卵的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

10 李知新;田占成;謝俊仁;劉光遠(yuǎn);;長(zhǎng)角血蜱卵cDNA文庫的構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 莊璐;蜱攜帶病原體多樣性及長(zhǎng)角血蜱實(shí)驗(yàn)傳播SFTSV的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 湯晶;長(zhǎng)角血蜱共生菌來源的抗血栓多肽YY-39的分離純化與功能機(jī)理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 馮雪皎;我國長(zhǎng)角血蜱4個(gè)地理種群的遺傳多樣性分析[D];河北師范大學(xué);2016年

3 孫文英;長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因克隆、原核表達(dá)及功能分析[D];河北師范大學(xué);2016年

4 高小賀;伊維菌素對(duì)長(zhǎng)角血蜱發(fā)育和生殖的影響[D];河北師范大學(xué);2016年

5 鄭洪遠(yuǎn);長(zhǎng)角血蜱的野外生態(tài)學(xué)研究[D];河北師范大學(xué);2009年

6 張麗艷;長(zhǎng)角血蜱功能基因的篩選、克隆、表達(dá)及免疫功能的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

7 李知新;長(zhǎng)角血蜱生物學(xué)特性研究及免疫原基因的篩選[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 劉仁潔;長(zhǎng)角血蜱卵巢發(fā)育中交配效應(yīng)的研究[D];河北師范大學(xué);2012年

9 王路;長(zhǎng)角血蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的原核、真核表達(dá)及其結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 唐堯;長(zhǎng)角血蜱飽血因子基因的原核表達(dá)與功能分析[D];河北師范大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群防御素基因克隆、原核表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：279041