本文關(guān)鍵詞：抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基因Bts1m的轉(zhuǎn)基因棉株，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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第 31 卷 第 1 期 2005 年 1 月 108~ 113 頁

作 物 學(xué) 報 ACTA AGRONOMICA SINICA

Vol. 31, No. 1 pp. 108- 113 Jan. , 2005

抗草甘膦基因 aroAM12 及抗蟲基因 Bts1m 的轉(zhuǎn)基因棉株
趙福永
1000

80) 1

謝龍旭

1, 2

田穎川

3

徐培林

1, * y

( 1 中山大學(xué)基因工程教育部重點實驗室, 廣東廣州 510275; 2 河南師范大 學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453002; 3 中國科 學(xué)院微生物 研究所, 北 京

摘 要: 構(gòu)建了一種新的植物高效表達載體 pAM12 s1m, 其上攜帶有通過基 因優(yōu)化( gene shuffling) 技術(shù) 獲得的抗 草甘膦突 變基因( aroAM12 ) 和抗蟲人工合成重組 Bt 基因( Bts1m) 。aroAM12 基 因表達 由 CaMV35S 啟 動子控制, Bts1m 基因 表達由 2E 35S 啟動子和 8 因子控制。以棉花無菌苗下胚軸為 外植體, 采用 農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法 將 aro AM12 和 Bts1m 基 因?qū)?棉花品 種石遠(yuǎn) 321 中, 以 aroAM12 基因作為選擇標(biāo)記, 草甘膦為選擇劑直 接篩選 獲得 52 棵再 生植株。PCR 和 Southern blot 分析 表明再生植株均整合有 aroAM12 基因, 其中 38 棵植株同時整合有 aroAM12 和 Bts1m 基 因。Northern blot、 Western blot 分析 進一步證明整合到植株中的兩個基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯 水平上進行了 有效表達。離 體葉片草甘 膦抗性和 蟲試實 驗證明, 獲 得的轉(zhuǎn)基因棉花對草甘膦和棉鈴蟲具有較 強的抗性。 關(guān)鍵詞: 轉(zhuǎn)基因棉花; 草甘膦; aroAM12 基因; Bts1m 基因; 選擇標(biāo)記 中圖分類號: S562

Glyphosate resistant and Bollworm resistant Transgenic Cotton Plants with the aroAM12 and Bts1m Genes
ZHAO Fu -Yong1 , XIE Long 1, 2 , TIAN Ying -Xu -Chuan3 , XU Pe- Lin1, * i
( 1 The Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education, Zhongshan University, Guangzhou 510275, Guangdong ; 2 College of Life Science , Henan Nor mal University, Xinxiang 453002, Henan ; 3 Institute of Microbiology , Chinese Academ of Sciences, Beijing 100080, China) y

Abstract: A new binary vector, pAM12 s1m, harboring the aroAM12 gene encoding 5 enolpyruvy- shikimate - phosphate l -3 synthase ( EPSPS) and a synthetic recombinant Bts1m toxin gene consisting of 331 N -terminal amino acids of CryIAc and 284 C terminal amino acids of CryIAb was constructed1 The truncated aroAM12 gene, which was obtained through gene shuffling technology, was ligated with a transit sequence of Arabidopsis EPSPS and expressed in cotton plants, and driven by cauliflower mosaic virus 35S ( CaMV35S) promoter1 The chimeric Bts1m toxin gene was fused with DNA sequence en coding PR1b secretary signal peptide and expressed under the control of 2E 35S promoter and / 80 translation enhancer se quence derived from tobacco mosaic virus1 The mutant EPSPS of aroAM12 gene product conferring highly resistant to glyphosate, the active ingredient in herbicide Roundupo , was used as a dominant selectable marker for cotton plant trans formation1 The genes were introduced into commercial cultivar Shiyuan 321 of cotton ( Gossypium hirsutum L1) by Agrobac terium -mediated transformation1 The transformants were selected directly on medium supplemented with 80 LmolP glypho L sate1 In this research, 52 regenerative cotton plantlets were obtained through screening1 Integration of aroAM12 and Bts1m genes was confirmed by PCR and Southern blot, the results indicated that all the 52 plants possessed the aroAM12 gene, 38 of which possessed both the aroAM12 and Bts1m genes1 Expression of both the genes was proved by Northern and West ern blots analyses1 Insect bioassay and glyphosate resistance assay indicated that the transgenic cotton plants obtained were highly resistant to glyphosate and insect1 Key words: Transgenic cotton; Glyphosate; aroAM12 gene; Bts1m gene; Selective marker
R

棉花是一種重要的經(jīng)濟作物, 近年來雜草和蟲 害已成為制約皮棉產(chǎn)量和質(zhì)量的兩個主要因素。常

規(guī)育種途徑因抗性種質(zhì)資源匱乏而難以解決問題, 因此利用基因工程技術(shù), 將抗除草劑基因和抗蟲基

y

基金項目: 國家/ 8630 高技術(shù)研究發(fā)展計劃( 2001AA212191) 和廣州市科技計劃( 2001 Z -01) 資助。 - -040 作者簡介: 趙福永( 1976- ) , 男, 湖南衡山人, 博士研究生, 研究方向: 植物基因工程。 * 通訊作者: 徐培林。Tel: 020 -84038085; E -mail : 13640737322@ 1631 net Received( 收稿日期) : 2003 -20, Accepted( 接受日期) : 2003 -031 -06 -12

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趙福永等: 抗草甘膦基因 aroAM12 及抗蟲基因 Bts1m 的轉(zhuǎn)基因棉株

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因同時導(dǎo)入棉花, 培育抗除草劑和抗蟲雙抗轉(zhuǎn)基因 棉花新品種, 一方面不僅可以降低植棉投入, 增加棉 農(nóng)收入, 另一方面還可簡化棉花栽培體系, 在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)上具有重要意義。同時, 抗除草劑基因在棉花雜 交育種上還可作為重要的遺傳標(biāo)記。目前已有多種 [ 1] 抗除草劑和抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花報道, 國外Tro linder [2] [ 3] 與 Bayley 將 抗 2, 4 D 的 tf dA 基因、 Keller 將 抗 PPT 的 bar 基因 成功導(dǎo)入到棉花中, 獲得抗 除草劑 [ 4] 轉(zhuǎn)基因棉花。Monsanto 公司的 Perlak 等將 Bt 基因 導(dǎo)入到棉花中, 并開始商品化生產(chǎn)。國內(nèi)學(xué)者也相 繼將抗 2, 4 的 tf dA 基因和改造過的系列 Bt 及雙 -D [ 5~ 8] 價抗蟲基因轉(zhuǎn)入到棉花中 。國外將草甘膦抗性 基因轉(zhuǎn)入到煙草、 番茄等作物的研究較多, 但成功轉(zhuǎn) [ 9] 化棉花的報道很少。Nida 等 將 CP4 EPSPS 編碼基 因轉(zhuǎn)化棉花, 該基因只作為草甘膦抗性的目的性狀 基因, 而不作為選擇標(biāo)記。國內(nèi)還未見將草甘膦抗 性基因轉(zhuǎn)入到棉花中的報道。本研究所采用的草甘 膦抗 性 基因 aroAM12 是 通 過基 因 優(yōu) 化技 術(shù) ( gene [ 10] shuffling) 而獲得, 抗蟲基因 Bts1m 由中國 科學(xué)院 微生物研究所田穎川研究員等改造人工合成。應(yīng)用 分子克隆技術(shù)將該兩個基因整合到同一個質(zhì)粒上, 構(gòu)建成植物高效表達載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化 棉花, 并首次利用 aroAM12 基因為選擇標(biāo)記, 直接應(yīng) 用草甘膦篩選獲得抗草甘膦抗蟲雙抗轉(zhuǎn)基因棉花。

用 Hind ? + Xba ? 分 別 切 割 pBtpCR211 和 pGRA1300, 回收相應(yīng)片段, 連接后得到 植物高效表 [ 11] 達雙元載體 pAM12 s1m( 圖 1) , 采用氯化鈣法 將 pAM12 s1m 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 LBA4404。 115 棉花的轉(zhuǎn)化及再生 將 3~ 5 日齡的無菌苗下胚軸切成 3~ 5 mm 切 段, 用含 pAM12 s1m 質(zhì) 粒 的農(nóng) 桿 菌 LBA4404 菌液 ( OD600 = 016) 感染 7 min, 滅菌濾紙上吸干殘余菌液 后, 接種到鋪有一張滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上( MS + 3% 葡萄糖+ 011 mgP 2, 4 + 011 mgP KT + 200 L -D L mgP 乙酰丁香酮 + 012% Gelrite, pH 510) 。暗培養(yǎng) L 48 h 后, 轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上( MS + 3% 葡 萄糖+ 011 mgP 2, 4 D + 011 mgP KT + 500 mgP L L L Cef + 012% Gelrite, pH 518) , 培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)移到含 80 L P 草甘膦的相同培養(yǎng)基上, 誘導(dǎo)抗性愈傷組 mol L 織的形成, 每 30 d 繼代一次。2~ 3 個月后, 將誘導(dǎo) 出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基( MS + 3% 葡萄糖 + 0191 gP MgCl2 + 012% Gelrite, pH 518) 上, 待出現(xiàn) L 米粒狀胚性愈 傷時, 轉(zhuǎn)移到 分化培 養(yǎng)基 ( 無 NH 4 、 KNO3 加倍的 MS+ B5 + 1 gP 天門冬酰胺+ 2 gP 谷 L L 氨酰胺+ 2% 葡萄糖+ 0125% Gelrite, pH 518) 上, 誘 導(dǎo)胚狀體的成熟和植株再生, 待再生苗形成良好根 系時, 采用低溫移植法將其移栽到大棚中; 對于無根 或根生長不好的轉(zhuǎn)基因苗采用嫁接法移栽。 116 再生植株的 PCR 分析 棉花 DNA 的提取參照 Bushra 等 的方法。根 據(jù) aroAM12 和Bts1m 基因序列, 設(shè)計兩對特異性引 物。aroAM12 基 因 特 異 引 物 P1: 5c CATGCCATG GAATCCCTGACGTTACAA 3 P2: 5c CGCGGATCCT - c, TAGC AGGCTACTCATTC 3 Bts1m 基因特異引物 P3: - c; 5-TATCCCATTGTTCGCAGTCC 3 P4: 5-CATCACGA c - c, c CTCAAGTTGTTA 3c。 反 應(yīng) 參 數(shù) 為: 94 e 預(yù) 變 性 5 min; 94 e 1 min, 54 e 1 min, 72 e 1 min, 循環(huán) 30 次; 72 e 延伸 10 min。 117 轉(zhuǎn)基因棉花離體葉片草甘膦抗性實驗 試驗葉片取自相同葉期轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)化植株, 分別置于培養(yǎng)皿中, 葉柄處用沾水棉球保濕, 用不同 R 濃度的草甘膦( Roundup o , Monsanto) 均勻涂抹葉片, 觀察葉片受損傷情況。 118 轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲實驗 將經(jīng) PCR 檢測呈陽性( Bts1m 基因) 的棉花轉(zhuǎn)化 株主莖第 5 葉放入墊有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中, 以非 轉(zhuǎn)化 株作為 對照, 以 2 齡 棉鈴蟲 ( Helicoverpa armigera, 中山大學(xué)生物防治國家重點實驗室提供) 作為 受試蟲, 每皿接種 6 頭, 置于( 25 ? 2) e 和 16 8 h 光 P
[ 12] +

1
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材料與方法
菌株和質(zhì)粒

大腸桿 菌 XL1 Blue 和根 癌農(nóng)桿菌 LBA4404 由 本實驗室保存, 含 Bts1m 基因的質(zhì)粒 pBts1m 由中科 院微生物所田穎川研究員贈送, 含 aroAM12 基因的 pGRA1300、 pCR211M12 質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存。 112 植物材料 陸地棉栽培品種石遠(yuǎn) 321 種子由中國農(nóng)科院棉 花研究所劉正德研究員饋贈。 113 酶與試劑 各種限制性內(nèi)切酶、 連接酶等購自 Promega 公 TM 司; Hexal Label Plus DNA Labeling Kit 、 Western Blot Kit BCPIP NBT System 購自 MBI Fermentas 公司; 草甘 R 膦( Roundup o ) 購自 Monsanto 公司; PCR 引物由上海 博亞( BioAsia) 生物技術(shù)公司合成。 114 植物表達載體的構(gòu)建 用 Hind ?+ Sal ?酶切質(zhì)粒 pBts1m, 回收含 2E 35S 8 BtS1m 片 段; 用 Hind ? + Xho ? 酶 切 質(zhì) 粒 - pCR211M12, 回收含 Nos 片段, 將回收的 兩 DNA 片 段經(jīng) T 4 DNA Ligase 連接 后, 得到 pBtpCR211 質(zhì)粒。

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暗周期的培養(yǎng)箱中。接蟲后第 3、 天統(tǒng)計死亡率、 6 活蟲體重及葉片受害情況。 119 轉(zhuǎn)基因棉花 Southern blot 分析 取 10 L 總 DNA, 經(jīng) Hind ?完全酶切后, 018% g [ 11] 瓊脂糖凝膠電泳, 參照5分子克隆實驗指南6 方法 轉(zhuǎn)膜與雜交。 1110 轉(zhuǎn)基因棉花的 Northern blot 分析 棉花 RNA 的提取參照夏蘭芹等的方法 。取 10 L RNA, 112% 甲醛變性凝膠電泳, 參照5 分子克 g [ 11] 隆實驗指南6 方法轉(zhuǎn)膜與雜交。 1111 轉(zhuǎn)基因棉花 Western blot 分析 [ 9] 棉花可 溶性粗蛋白的 提取參照 Nida 等的 方 [ 14] 法。采用 Bradford 法測定蛋白濃度 。參照 West ern Blot Kit 所提供的方法, 分別用 EPSPS 抗血清( 兔 抗血清, 效價 1B200, 實驗室自制) 和 Bt 毒蛋白抗血 清( 兔抗血清, 效價 1B250, 田穎川研究員贈送) 進行 Western blot 檢測。
[ 13]

區(qū)序列, 同時在該基因的前面加有增強翻譯功能的 煙草花葉病毒( TMV) RNA 的 8 片段編碼序列和 2E 35S 強啟動子序列。

圖1 Fig 1 1

植物表達載體 pAM12 s1m -

Construction of the plant expression vector pAM12 s1m -

2
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結(jié)果與分析

植物雙元表達載體 pAM12 -s1m 的構(gòu)建 本研究將 aroAM12 和 Bts1m 基因整合到同一個 質(zhì)粒 中, 得 到 抗草 甘 膦、 蟲植 物高 效 表達 載 體 抗

212 再生棉花植株的 PCR 檢測 通過草甘膦直接篩選共獲得 52 棵再生植株, 用 aroAM12 基因特 異性引物擴增, 均出現(xiàn) 預(yù)期的 113 kb 片段; 用 Bts1m 基因特異性引物擴增, 其中有 38 棵植株出現(xiàn)預(yù)期的 0196 kb 片段。該結(jié)果表明在攜 帶有外源基因的 T -DNA 片段整合到植物基因組的 過程中, 約有 2619% ( 14P 的 Bts1m 基因丟失。圖 52) 2 為部分轉(zhuǎn)化植株 PCR 擴增結(jié)果。 213 轉(zhuǎn)基因棉花的草甘膦抗性檢測 選取主莖第 5 葉進行離體試驗, 用不同濃度的 草甘膦 涂抹, 5 d 后對照葉 片在 10 mmolP 變 黃枯 L 萎, 而轉(zhuǎn)基因棉花葉片在 50 mmolP 逐 漸失綠變黃 L ( 圖 3) , 表明在離體條件下, 棉花抗性提高了約 5 倍。

pAM12 s1m ( 圖 1) 。在 aroAM12 基因 5 端連接了一 c 段 240 bp 的擬南芥 EPSPS 信號肽 ASP 編碼區(qū)序列, 該基因表達由 CaMV35S 啟動子控制。在 Bts1m 基因 5c端添加了煙草致病相關(guān)蛋白的信號肽( PR1b) 編碼

圖2 轉(zhuǎn)化棉花株的 PCR 檢測 Fig12 PCR analysis of putative transformants and untransformed cotton pl ants ( A) : aroAM12 引物擴增; ( B) : Bts1m 引物擴增; Lane M : DNA marker; Lane P: pAM12 -s1m 質(zhì)粒; Lane N : 非轉(zhuǎn)化植株; Lanes 1~ 10: 轉(zhuǎn)化植株 PCR analysis using two primer sets: aroAM12 ( A ) and Bts1m ( B) gene specif ic; Lane M: DNA marker; Lane P: pAM 12 s1m plasmid; Lane N: Untransformed plant ; Lanes 1- 10: Put ative transformants

圖 3 轉(zhuǎn)基因棉株離體葉片對草甘膦的抗性 Fig13 Anal ysis of transgenic cotton resistance to gl yphosate TG : 轉(zhuǎn)基因植株; CK: 非轉(zhuǎn)化植株。從左到右草甘膦的涂抹濃度依次為 0、 10、 50 mmol L1 5、 30、 P TG : Transgenic plant ; CK: Untransformed plant1 The concentrat ion of glyphosate swabbed from left to right is 0, 5, 10, 30, 50 mmolP respectively1 L,

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轉(zhuǎn)基因棉花抗棉鈴蟲檢測 抗蟲性比較發(fā)現(xiàn), 大部分轉(zhuǎn)化植株( Bts1m PCR

因的 T DNA 向植 株染色體 整合的過 程中, 有部分 Bts1m 基因的丟失, 這一結(jié)果同 PCR 結(jié)果相符合。

陽性) 表現(xiàn)出明顯的抗蟲性, 葉 片僅被取食幾 個小 孔, 受試蟲就死亡, 而對照葉片則大部分被取食。圖 4 為經(jīng)過 3 d 后部分葉片被棉鈴蟲取食的情況。其 具體發(fā)育和死亡情況見表 1。 215 轉(zhuǎn)化棉花的 Southern blot 分析 隨機挑 選的 6 株棉花 的總 DNA 進 行 Southern

blot 分析。雜交結(jié)果表明, 1~ 6 號株均出現(xiàn)了雜交 信號, 結(jié) 合 圖5 可 以 推斷 出其 雜 交 條帶 數(shù) 就 是 -A aroAM12 基因插入植株的拷貝數(shù), 分別為 2、 2、 1、 1、 1、 圖 5 B) 。對于 Bts1m 基因, 只有 1~ 4 號株出現(xiàn) 1( 了雜交信號, 其拷貝數(shù)依次為 1、 3、 而 5、 號兩 2、 1, 6 棵轉(zhuǎn)化植株同對照植株一樣, 無雜交信號 出現(xiàn)( 圖 5 C) 。這一結(jié)果表明在攜帶有 aroAM12 和 Bts1m 基 表1 Table 1 圖4 轉(zhuǎn)基因棉花對棉鈴蟲( Helicoverpa armigera ) 的抗性 Fig14 Leaf bioassay of transgenic cotton leaves against Heli coverpa armigera

1~ 3: 轉(zhuǎn)基因植株; 4: 非轉(zhuǎn)化植株。 1- 3: Transgenic plant ; 4: U ntransformed plant1

轉(zhuǎn)基因棉花對棉鈴蟲( Helicoverpa armigera ) 的抗性結(jié)果

Effects of transgenic cotton on survival and development of Helicoverpa armigera second instar larvae at three and six days infestati on 死亡率 Mort ality ( % ) 3 days 8515 8010 6510 8510 8210 8415 7010 8515 0 6 days 100 9010 8010 100 100 9510 8315 100 0 存活幼蟲體重 Weight of survival H 1 a1 ( mg) 3 days 0175 ? 0 30 1 0 8 ? 0 20 1 1 0 8 ? 0 35 1 1 0165 ? 0 28 1 0 7 ? 0 25 1 1 0175 ? 0 33 1 0185 ? 0 20 1 0175 ? 0 25 1 5 5? 0 4 1 1 葉片受損級別 Leaf damage grade + + + + + + + + + + + + + + + + + +

植株編號 No1 of plant 1 2 3 4 5 6 7 8 CK

注: 1~ 8: 轉(zhuǎn)基因植株; CK: 非轉(zhuǎn)化植株 1 N otes: 1- 8: Transgenic plant s; CK : Unt ransformed plant1

圖 5 轉(zhuǎn)基因棉花植株 Southern blot 分析 Fig 5 1 Southern blot analysis of transgenic cotton plants ( A) pAM 12 s1m T-DNA 區(qū)域示意圖。T 0 代棉花基因組 DNA 經(jīng) H in d? 酶切后分別與( B) aroAM12 和( C) Bts1m 基因特 異性探針雜交。N : 非轉(zhuǎn)化植株 DNA; 1~ 6: 轉(zhuǎn)化植株 DNA。 ( A) Schemat ic map of the T-DNA of the binary vector pAM12 -s1m1 Total genomic DNA of T 0 transformants was digest ed wit h Hi nd ? and hybridized with aroAM12 DNA fragment ( B) or with Bts1m DNA fragment ( C) Lane N: Untransformed plant; Lanes 1- 6: Transformants1

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轉(zhuǎn)基因棉花的 Northern blot 分析 Northern blot 結(jié)果表明, 用 aroAM12 基因探針雜

Bts1m 基因在轉(zhuǎn)錄水平上得到了表達。 217 轉(zhuǎn)基因棉花的 Western blot 分析 為檢測 aroAM12 和 Bts1m 基因是否正確表達出 EPSPS 和 Bt 毒蛋白, 取 10 L 總的可溶性蛋白進行 g Western blot 分析。圖 7 中, 6 個隨機挑選的轉(zhuǎn)基 -A 因棉花粗蛋白樣品同 EPSPS 抗血清雜交后均在 48 kDa 處出現(xiàn)雜交帶, 同陽性對照 結(jié)果完全相同。圖 7 B 中, 同樣的蛋白樣品同 Bt 毒素蛋白抗血清雜交 后, 只有 1~ 4 出現(xiàn)了同陽性對照相同大小的 68 kDa 雜交帶, 且雜交信號存在一定差異。

交時, 1~ 6 號轉(zhuǎn)化植株均出現(xiàn)了 1130 kb 左右的雜 交條帶, 與預(yù)期值大小相近, 而非轉(zhuǎn)化植株未出現(xiàn)任 何雜交信號, 表明 aroAM12 基因在轉(zhuǎn)錄水平上進行 了有效表達。從雜交信號上看, 2 號植株最強, 1、 3 號次之, 4、 6 號相對較弱( 圖 6 5、 -A) 。用 Bts1m 基因 探針雜交時, 只有 1~ 4 號株出現(xiàn)了 0196 kb 左右的 雜交條帶, 與期望值大小相近, 有 2 株轉(zhuǎn)化植株( 5、 6 號) 未出 現(xiàn)雜 交信 號( 圖 6 B) , 表明 1~ 4 株中 的 -

Fig 6 1

圖 6 轉(zhuǎn)基因棉花植株 Northern blot 分析 Northern blot analyses of transgenic cotton plants

N: 非轉(zhuǎn)化植株; 1~ 6: 轉(zhuǎn)化植株。植株 RNA 分別與 aroAM12 ( A ) 和 Bts m ( B) 基因探針雜交。 1 Line N : Untransformed plant ; Lanes 1- 6: Cotton transformant s The RNA was hybridized with aroAM12 DNA fragment ( A) 1 or with Bts m DNA fragment ( B) 1 1

Fig 7 1

圖7 轉(zhuǎn)基因棉花植株 Western blot 分析 Western blot anal ysis of transgenic cotton plants

( A ) : EPSPS 抗血清檢測。M: 分子量標(biāo)記; P: EPSPS 蛋白; N : 非轉(zhuǎn)化植株; 1~ 6: 轉(zhuǎn)基因植株。 ( B) : Bt 毒蛋白抗血清檢測。 : 分子量標(biāo)記; P: Bt 毒素蛋白; N: 非轉(zhuǎn)化植株; 1~ 6: 轉(zhuǎn)基因植株。 M ( A) : The EPSPS prot ein of aroAM12 gene product was detected using ant- EPSPS serum M: Molecular marker; Lane P: EPSPS prot ein; i 1 Lane N : Untransformed plant1 ( B) : The Bt toxin protein of Bts1m gene product was det ected using ant- Bt toxin i serum1 M : Molecular marker; Lane P: Bt toxin protein; Lane N : Untransformed plant; Lanes 1- 6: Transformants1

3

討論
目前, 棉花轉(zhuǎn)化過程中的篩選標(biāo)記基因大部分

下降, 導(dǎo)致草甘膦抗性水平的提高

[ 10]

。構(gòu)建高效表

達載體時, 在 aroAM12 基因上游連接了一段來自擬 南芥 EPSPS 信號肽 ASP 編碼區(qū)序列, 從而能夠大大 提高轉(zhuǎn)基因植株的抗性, 因為整個芳香族氨基酸的 合成過程是在 葉綠體中進行
[ 15]

采用 npt ?( 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶) 基因或 htp ( 潮霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶) 基因。草甘膦作為除草劑具有廣譜、 高 效、 低殘留量的特性, 是一種理想的篩選劑。草甘膦 作用的靶標(biāo)酶是莽草 酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移 酶( EPSPS) , 其作用機制在于抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸的生物 合成。抗草甘膦育種通常有 3 條途徑: 導(dǎo)入修飾的 或突變的酶靶基因; 導(dǎo)入過量表達的酶靶基因; 導(dǎo)入 草甘膦降解酶基因。本研究所采用的草甘膦抗性基 因 aroAM12 是通過基因優(yōu)化技術(shù)( gene shuffling ) 獲 得的, 其表達產(chǎn)物在多個氨基酸位點發(fā)生突變, 造成 酶對底物 PEP 親和性增加, 同時對草甘膦的親和性

的。采用農(nóng)桿菌介

導(dǎo)法, 以 aroAM12 為選擇標(biāo)記基因篩選出的 T 0 代轉(zhuǎn) 化植株抗草甘膦, 說明草甘膦是一種有效的篩選劑。 Bts1m 基因是人工合成的重組基因, 即由 CrylAb N 端的 331 個氨基酸和 CrylAc C 端 284 個氨基酸組合 而成
[ 16]

。在該基因的 5 c端有加倍的增強子元件 2E -

35S 以增強基因轉(zhuǎn)錄功能; 5c端 8 序列是蛋白質(zhì)翻 譯過程中核糖體的結(jié)合位點, 可大幅提高蛋白質(zhì)的 [ 17] 表達量 。另外, 為使植物表達的 Bt 殺蟲蛋白能 分泌到細(xì)胞 外間 隙以提 高殺 蟲蛋白 的穩(wěn) 定性, 在

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趙福永等: 抗草甘膦基因 aroAM12 及抗蟲基因 Bts1m 的轉(zhuǎn)基因棉株

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Bts1m 基因前添加 了煙草致 病相 關(guān)蛋白 的信號 肽 ( PR1b) 編碼區(qū)序列, 其作用與 ASP 序列類似。該基 因 3c端的 polyA 序列的添加, 提高了殺蟲基因 mRNA 的穩(wěn)定性。通過篩選得到的抗蟲棉花植株盡管單株 間所表現(xiàn)出的抗性呈現(xiàn)一定的差異, 但抗蟲能力都 較強, 并且植株的其他生長性狀并未受到影響, 說明 組建的嵌合 Bts1m 基因進行了充分的表達。South ern blot 結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)基因植株中的外源 基因的 拷貝數(shù) 和整 合位 點 均不 完全 相同。結(jié) 合 Northern blot、 Western blot 及棉花離體葉片草甘膦抗性和蟲試 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因植株抗性的強弱同插入的基 因拷貝數(shù)并不呈正相關(guān), 有些多拷貝插入的植株抗 性反而較低, 這可能是由 基因沉默現(xiàn)象造成的
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關(guān)于轉(zhuǎn)化植株中 aroAM12 和 Bts1m 基因能否穩(wěn)定地 遺傳給后代以及遺傳方式如何, 有待進一步的研究 和分析。
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