水稻ABP cDNA克
本文關(guān)鍵詞：Waxy基因的RNA沉默使轉(zhuǎn)基因小麥種子中直鏈淀粉含量下降(英文)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2008年
水稻ABP cDNA克隆、原核表達(dá)及RNA沉默載體構(gòu)建
文春描
【摘要】： 高等植物中普遍存在的生長(zhǎng)素吲哚乙酸(IAA),對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育(如植株形態(tài)、器官分化、種子形成等)起著重要的調(diào)節(jié)作用。生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白(auxin-bindingprotein,ABP)是生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)的先驅(qū),它與生長(zhǎng)素一起調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,在細(xì)胞中的含量水平既關(guān)系到細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng),又直接影響細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性。 水稻是世界上最重要的糧食作物之一,也是重要的模式植物之一,深入研究水稻ABP基因的功能及其調(diào)控方式并獲得突變材料將為水稻遺傳改良打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究以粳稻日本晴幼苗的RNA為材料,用RACE及重組PCR技術(shù)克隆ABP全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)。同時(shí),利用獲得的ABP進(jìn)行了原核表達(dá)載體構(gòu)建及RNA沉默載體構(gòu)建、表達(dá)研究等,為獲得水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性方面的突變材料作了一些探索性的工作。主要研究結(jié)果如下: 1、克隆了水稻ABP全長(zhǎng)cDNA,測(cè)序結(jié)果已登錄到GenBank,登錄號(hào)為EU595028。該cDNA全長(zhǎng)920 bp(polyA除外)編碼206個(gè)氨基酸。含有GAGA轉(zhuǎn)錄順式作用元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、polyA加尾信號(hào)、糖皮質(zhì)激素作用位點(diǎn)等轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)。序列分析顯示所得核苷酸序列與玉米生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因(zm-ABP1)的核苷酸序列同源性達(dá)79%,氨基酸序列同源性達(dá)78%,同樣具有3個(gè)氨基酸保守結(jié)構(gòu)域,C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別信號(hào)KDEL和1個(gè)糖基化位點(diǎn)(NSTF),表明此基因在不同物種間保守性較高。跨膜預(yù)測(cè)分析顯示,水稻ABP在1-44號(hào)氨基酸信號(hào)肽部分存在跨膜區(qū)。因此,推測(cè)水稻ABP可能是一種大量存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌型蛋白,且位于質(zhì)膜進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)與其它蛋白錨定。二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,其功能結(jié)構(gòu)域主要集中于β-片層結(jié)構(gòu)區(qū)域,該區(qū)域與ABP的生物學(xué)功能關(guān)系密切,預(yù)測(cè)綜合分析顯示可形成有效結(jié)合生長(zhǎng)素的區(qū)域。 2、分別構(gòu)建包含水稻ABP全長(zhǎng)cDNA和編碼框的原核表達(dá)載體,以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為蛋白表達(dá)系統(tǒng)嘗試進(jìn)行了GST融合表達(dá),以獲得純化的水稻ABP進(jìn)行生化、免疫和蛋白質(zhì)相互作用方面的研究。但經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度梯度多次篩選,并未觀察到與陰性對(duì)照有差異條帶,因此可初步認(rèn)為水稻ABP表達(dá)的條件特殊,不能在此原核表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)或者水稻ABP對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)不利導(dǎo)致不能有效表達(dá)。 3、為了能用外界誘導(dǎo)因素調(diào)控植物體內(nèi)的RNA沉默,用來(lái)自擬南芥的HSP18.2熱激啟動(dòng)子構(gòu)建熱激誘導(dǎo)型真核表達(dá)載體pCAMBIA1301-HSP,并通過(guò)GUS基因的表達(dá)證明此表達(dá)載體能在熱激條件下有效表達(dá)水稻愈傷組織中的外源基因。根據(jù)水稻ABP cDNA序列和水稻基因組序列的比對(duì)結(jié)果,確定了水稻ABP基因的外顯子和內(nèi)含子的位置關(guān)系,通過(guò)引物設(shè)計(jì)和重組PCR方法得到以水稻ABP基因內(nèi)含子為莖環(huán)結(jié)構(gòu),外顯子為反向互補(bǔ)序列的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)片段。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了熱激誘導(dǎo)型的RNA沉默載體pCAMBIA1301-HSP-ABP并轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織以獲得水稻ABP基因誘導(dǎo)型缺陷突變材料。轉(zhuǎn)化后的材料死亡,推測(cè)存在可能因ABP缺損導(dǎo)致了細(xì)胞生長(zhǎng)停止或致死。因此,下一步的研究可在表達(dá)載體上插入阻遏蛋白基因,提高誘導(dǎo)型載體的嚴(yán)謹(jǐn)性。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：S511
【目錄】：
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8 劉學(xué)群;水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因的篩選與恢復(fù)基因的精細(xì)定位[D];武漢大學(xué);2004年
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10 段遠(yuǎn)霖;三個(gè)水稻生殖發(fā)育突變體的形態(tài)學(xué)觀察、遺傳分析及有關(guān)基因的分子標(biāo)記定位研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2001年
中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條
1 文春描;水稻ABP cDNA克隆、原核表達(dá)及RNA沉默載體構(gòu)建[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年
2 馮婷;斑點(diǎn)叉尾鮰干擾素α基因的克隆和原核表達(dá)及生物活性初探[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年
3 孟憲梅;水稻若干形態(tài)、生理指標(biāo)與品種抗旱性關(guān)系的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
4 方軍;轉(zhuǎn)HVA1基因水稻的鑒定及其快繁殖體系的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
5 俞偉偉;水稻半不育性的遺傳分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
6 吳桂成;水稻超高產(chǎn)栽培途徑的初步研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2007年
7 郝文媛;水稻高效受體系統(tǒng)的建立及兩種遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
8 魏峰;水稻劍葉主要光合參數(shù)衰退進(jìn)程的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年
9 韋海宏;水稻RNPR1基因的功能鑒定[D];廣西大學(xué);2003年
10 樊葉楊;水稻矮稈基因d62（t）的精細(xì)定位[D];浙江大學(xué);2004年
本文關(guān)鍵詞：Waxy基因的RNA沉默使轉(zhuǎn)基因小麥種子中直鏈淀粉含量下降(英文)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
本文編號(hào)：170911
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