本文關(guān)鍵詞：Waxy基因的RNA沉默使轉(zhuǎn)基因小麥種子中直鏈淀粉含量下降(英文)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《四川農(nóng)業(yè)大學》 2008年

水稻ABP cDNA克隆、原核表達及RNA沉默載體構(gòu)建

文春描  

【摘要】： 高等植物中普遍存在的生長素吲哚乙酸(IAA),對植物的生長發(fā)育(如植株形態(tài)、器官分化、種子形成等)起著重要的調(diào)節(jié)作用。生長素結(jié)合蛋白(auxin-bindingprotein,ABP)是生長素調(diào)節(jié)過程中信號傳導(dǎo)的先驅(qū),它與生長素一起調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程,在細胞中的含量水平既關(guān)系到細胞的相對生長,又直接影響細胞對生長素的敏感性。 水稻是世界上最重要的糧食作物之一,也是重要的模式植物之一,深入研究水稻ABP基因的功能及其調(diào)控方式并獲得突變材料將為水稻遺傳改良打下堅實基礎(chǔ)。本研究以粳稻日本晴幼苗的RNA為材料,用RACE及重組PCR技術(shù)克隆ABP全長cDNA,并對其序列進行了生物信息學分析和預(yù)測。同時,利用獲得的ABP進行了原核表達載體構(gòu)建及RNA沉默載體構(gòu)建、表達研究等,為獲得水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性方面的突變材料作了一些探索性的工作。主要研究結(jié)果如下: 1、克隆了水稻ABP全長cDNA,測序結(jié)果已登錄到GenBank,登錄號為EU595028。該cDNA全長920 bp(polyA除外)編碼206個氨基酸。含有GAGA轉(zhuǎn)錄順式作用元件、核糖體結(jié)合位點(RBS)、polyA加尾信號、糖皮質(zhì)激素作用位點等轉(zhuǎn)錄因子作用位點。序列分析顯示所得核苷酸序列與玉米生長素結(jié)合蛋白基因(zm-ABP1)的核苷酸序列同源性達79%,氨基酸序列同源性達78%,同樣具有3個氨基酸保守結(jié)構(gòu)域,C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識別信號KDEL和1個糖基化位點(NSTF),表明此基因在不同物種間保守性較高�？缒ゎA(yù)測分析顯示,水稻ABP在1-44號氨基酸信號肽部分存在跨膜區(qū)。因此,推測水稻ABP可能是一種大量存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌型蛋白,且位于質(zhì)膜進行信號傳導(dǎo)時與其它蛋白錨定。二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,其功能結(jié)構(gòu)域主要集中于β-片層結(jié)構(gòu)區(qū)域,該區(qū)域與ABP的生物學功能關(guān)系密切,預(yù)測綜合分析顯示可形成有效結(jié)合生長素的區(qū)域。 2、分別構(gòu)建包含水稻ABP全長cDNA和編碼框的原核表達載體,以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為蛋白表達系統(tǒng)嘗試進行了GST融合表達,以獲得純化的水稻ABP進行生化、免疫和蛋白質(zhì)相互作用方面的研究。但經(jīng)誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度梯度多次篩選,并未觀察到與陰性對照有差異條帶,因此可初步認為水稻ABP表達的條件特殊,不能在此原核表達系統(tǒng)中有效表達或者水稻ABP對大腸桿菌的生長不利導(dǎo)致不能有效表達。 3、為了能用外界誘導(dǎo)因素調(diào)控植物體內(nèi)的RNA沉默,用來自擬南芥的HSP18.2熱激啟動子構(gòu)建熱激誘導(dǎo)型真核表達載體pCAMBIA1301-HSP,并通過GUS基因的表達證明此表達載體能在熱激條件下有效表達水稻愈傷組織中的外源基因。根據(jù)水稻ABP cDNA序列和水稻基因組序列的比對結(jié)果,確定了水稻ABP基因的外顯子和內(nèi)含子的位置關(guān)系,通過引物設(shè)計和重組PCR方法得到以水稻ABP基因內(nèi)含子為莖環(huán)結(jié)構(gòu),外顯子為反向互補序列的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)片段。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了熱激誘導(dǎo)型的RNA沉默載體pCAMBIA1301-HSP-ABP并轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織以獲得水稻ABP基因誘導(dǎo)型缺陷突變材料。轉(zhuǎn)化后的材料死亡,推測存在可能因ABP缺損導(dǎo)致了細胞生長停止或致死。因此,下一步的研究可在表達載體上插入阻遏蛋白基因,提高誘導(dǎo)型載體的嚴謹性。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：S511
【目錄】：

摘要3-5

Abstract5-9

第一章 文獻綜述9-21

1 植物ABP研究進展9-16

1.1 ABP的性質(zhì)與細胞定位9-10

1.2 ABP的結(jié)構(gòu)及功能位點10-12

1.3 ABP基因12-13

1.4 ABP的分子機制及作用原理13-15

1.5 受體的終結(jié)15

1.6 展望15-16

2 RNA沉默技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用16-19

2.1 RNA干擾機理及優(yōu)勢16-17

2.2 RNA干擾設(shè)計及技術(shù)方法17-18

2.3 RNA干擾技術(shù)在植物中的應(yīng)用18

2.4 前景展望18-19

3 立題思想19-21

第二章 水稻生長素結(jié)合蛋白全長cDNA的克隆、序列及結(jié)構(gòu)分析21-38

1 材料與方法21-29

1.1 實驗材料21

1.2 實驗方法21-29

2 結(jié)果與分析29-35

2.1 水稻ABP mRNA的RT-PCR29-30

2.2 水稻ABP全長cDNA TA克隆質(zhì)粒鑒定30

2.3 水稻ABP cDNA序列測定及結(jié)果分析30-31

2.4 水稻ABP氨基酸序列及高級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果31-35

3 討論35-38

3.1 水稻ABP全長cDNA結(jié)構(gòu)分析35

3.2 水稻ABP結(jié)構(gòu)分析35-38

第三章 水稻生長素結(jié)合蛋白的原核表達研究38-49

1 材料與方法38-43

1.1 實驗材料38-39

1.2 實驗方法39-43

2 結(jié)果與分析43-46

2.1 水稻ABP全長cDNA編碼框TA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建43-44

2.2 水稻ABP全長cDNA重組pGEX-4T-2原核表達質(zhì)粒構(gòu)建44-45

2.3 水稻ABP cDNA編碼框序列重組pGEX-4T-2原核表達質(zhì)粒構(gòu)建45-46

2.4 水稻ABP在原核表達系統(tǒng)中的表達研究46

3 討論46-49

3.1 關(guān)于原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2和宿主菌46-47

3.2 關(guān)于重組原核表達載體的構(gòu)建策略47

3.3 關(guān)于水稻ABP在原核表達系統(tǒng)中無效表達分析47-49

第四章 水稻生長素結(jié)合蛋白的RNA干擾研究49-59

1 材料與方法49-52

1.1 實驗材料49

1.2 實驗方法49-52

2 結(jié)果與分析52-57

2.1 載體pCAMBIA1301-HSP構(gòu)建及鑒定52-55

2.2 真核表達載體pCAMBIA1301-HSP-ABP構(gòu)建及轉(zhuǎn)化55-57

3 討論57-59

3.1 HSP18.2啟動子在水稻愈傷組織中的啟動效率57

3.2 水稻ABP基因RNA沉默載體的構(gòu)建57

3.3 轉(zhuǎn)化RNA沉默載體的水稻愈傷組織死亡57-59

參考文獻59-63

致謝63-64

發(fā)表文章64

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10 樊葉楊;水稻矮稈基因d62（t）的精細定位[D];浙江大學;2004年

  本文關(guān)鍵詞：Waxy基因的RNA沉默使轉(zhuǎn)基因小麥種子中直鏈淀粉含量下降(英文)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：170911