發(fā)布時間：2016-11-06 13:45

  本文關(guān)鍵詞：亞油酸異構(gòu)酶基因在產(chǎn)油真菌中的異源表達及產(chǎn)物的生物合成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《江南大學(xué)》 2015年

高山被孢霉生物合成共軛亞油酸重組菌株的構(gòu)建及研究

郝丹輝  

【摘要】：共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸,其中兩種最重要的活性單體分別是cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA,均具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、增強機體免疫力等生理功能。其中trans-10,cis-12-CLA還可以減少體內(nèi)脂肪積累,增加肌肉組織含量。由于傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法存在著耗能大、副產(chǎn)物多等諸多問題,使得生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)物專一的生物法合成CLA的開發(fā)受到了越來越廣泛的關(guān)注。高山被孢霉(Mortierella alpina)是一種多不飽和脂肪酸(PUFAs)工業(yè)生產(chǎn)絲狀真菌,可以積累脂質(zhì)達到自身干重的50%。雖然高山被孢霉不具有合成CLA的能力,但是其亞油酸含量可以達到脂肪酸總量的10%左右,可作為亞油酸異構(gòu)酶的潛在底物。為了實現(xiàn)在高山被孢霉中生物合成CLA,以改善其功能性脂肪酸組成,提高商業(yè)應(yīng)用價值,本研究通過異源表達痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的亞油酸異構(gòu)酶(PAI),使得重組菌株具有了生物合成CLA的能力。并使用密碼子優(yōu)化、外源添加底物和特異性抑制劑的方法,通過不同策略提高重組菌株生產(chǎn)CLA的能力。對于高山被孢霉脂質(zhì)合成的基礎(chǔ)理論研究及產(chǎn)品開發(fā)均具有重要的意義。本課題主要結(jié)果如下:1.高山被孢霉異源表達亞油酸異構(gòu)酶重組菌株的構(gòu)建。首先PCR擴增出天然PAI基因(PAI),同時根據(jù)高山被孢霉的密碼子使用偏好表,對PAI序列進行密碼子優(yōu)化,獲得密碼子優(yōu)化后的o PAI基因,并構(gòu)建異源表達PAI的表達載體p BIG2-ura5s-PAI和p BIG2-ura5s-o PAI,經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型高山被孢霉,獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。同時對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化。2.亞油酸異構(gòu)酶基因在高山被孢霉重組菌株中表達情況的研究。對密碼子優(yōu)化前后PAI和o PAI基因的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平進行了分析。所有重組菌株中目標基因均明顯轉(zhuǎn)錄,且密碼子優(yōu)化前后對轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響,但經(jīng)過密碼子優(yōu)化的PAI基因(o PAI)的重組菌株P(guān)AI蛋白表達量較未優(yōu)化的有明顯提高。重組菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和脂質(zhì)組成分析表明,重組菌株與野生型菌株的產(chǎn)脂率和脂肪酸組成均無明顯差異,但在其中一株轉(zhuǎn)化子M.alpina-o PAI-3中檢測到微量的CLA,經(jīng)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定為trans-10,cis-12-CLA異構(gòu)體,該結(jié)果表明異源表達的PAI蛋白具有活性,可催化生物合成CLA。3.影響高山被孢霉重組菌株CLA產(chǎn)量的限制因素及優(yōu)化策略的研究。對異源表達PAI的高山被孢霉重組菌株CLA產(chǎn)量低的原因進行分析發(fā)現(xiàn),高山被孢霉積累的脂肪酸主要以甘油三酯的形式存在,游離態(tài)形式存在的亞油酸含量極少,故PAI的底物極少。在添加0.2%(w/w)外源底物游離態(tài)亞油酸以及5μM長鏈酰基輔酶A合成酶(ACSL)抑制劑后,M.alpina-o PAI-3中CLA產(chǎn)量分別達到了1.02%.和1.21%。兩者同時添加使CLA產(chǎn)量提高到了4.05%,與最初發(fā)酵培養(yǎng)的重組菌相比產(chǎn)量提高了近80倍。說明高山被孢霉在生物合成CLA方面具有很大的潛力。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

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4 蓋永鋒;金魚生長激素Ⅰ和人角質(zhì)細胞生長因子異源表達的研究[D];廈門大學(xué);2008年

5 王莉;輪枝鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶異源表達研究[D];華東師范大學(xué);2004年

6 王洪杰;嗜熱光合綠絲菌Chloroflexus aurantiacus固碳途徑中關(guān)鍵酶的分離和異源表達[D];杭州師范大學(xué);2012年

7 劉紅健;EpoK基因的異源表達及對4-單甲基埃博霉素D的環(huán)氧化作用研究[D];大連理工大學(xué);2012年

8 王輝;Lactobacillus casei磷脂酶A_2基因的異源表達及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[D];江南大學(xué);2015年

9 劉秋琳;干酪乳桿菌Lc18錳超氧化物歧化酶基因的克隆和異源表達[D];上海交通大學(xué);2010年

10 金雛鳳;尖吻蝮毒液類凝血酶的序列分析和異源表達[D];安徽大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：亞油酸異構(gòu)酶基因在產(chǎn)油真菌中的異源表達及產(chǎn)物的生物合成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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