本文關(guān)鍵詞：基因工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

生物技術(shù)通報(bào)
? 綜述與專論 ?

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００８ 年第 ４ 期

基因工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性研究進(jìn)展
肖碩
摘 要：

洪華珠

彭建新

（ 華 中 師 范 大 學(xué) 昆 蟲 學(xué) 研 究

所 ， 武 漢 ４３００７９）

基因工程菌 細(xì)胞 ）是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應(yīng)器， 是基因工程的研究主體之一。獲得使外源基因 （

高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞是基因工程的核心步驟與最終目的。基因工程菌重組質(zhì)粒穩(wěn)定性問題是基因工程菌 影響因素及提高穩(wěn)定性策略方面作簡要介紹并展 工業(yè)化生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)研究中的最主要問題 ， 就其在基因工程中的重要性、 開綜述。 關(guān)鍵詞： 基因工程 重組質(zhì)粒 穩(wěn)定性 策略

Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓ ｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｘｉａｏ Ｓｈｕｏ Ｈｏｎｇ Ｈｕａｚｈｕ Ｐｅｎｇ Ｊｉａｎｘｉｎ
（ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７９）

Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ ：

Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｓｕｂｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｎｅ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｐａｒｔ ｏｆ

ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔｅａｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｔｈｅ ｈａｒｄ ｃｏｒｅ ｓｔｅｐ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ａｉｍ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ， ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｒａｔｅｇｙ

狹 義 的 基 因 工 程 即 重 組 ＤＮＡ 技 術(shù) ， 其 基 本 過 程 主 要 包 括 以 下 的 ５ 個 方 面 ： ｌ） 從 供 體 細(xì) 胞 中 分 離 出 基 因 組 ＤＮＡ， 用 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 分 別 將 外 源

（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） 、 酒 酵 母 等 。在 重 組 基 因 工 程 菌 釀 培 養(yǎng) 過 程 中 ， 遇 到 的 主 要 問 題 有 ： ｌ） 有 機(jī) 酸 類 代 謝 副 產(chǎn) 物 積 累 并 抑 制 菌 體 生 長 和 產(chǎn) 物 的 表 達(dá) ； ２） 大 規(guī) 模 及 高 密 度 培 養(yǎng) 過 程 的 供 氧 限 制 ； ３） 外 源 基 因 高 表 達(dá) 引 起 宿 主 細(xì) 胞 生 理 負(fù) 擔(dān) 過 重 ； ４） 質(zhì) 粒 不 穩(wěn) 定 性 問 題。 中， 質(zhì)粒的穩(wěn)定性研究尤為重要， 對于一定結(jié) 其 構(gòu)的基因工程菌而言， 提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性對于基因 產(chǎn)物的生產(chǎn)及科學(xué)研究具有重要意義， 就基因工程 菌中影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素及提高穩(wěn)定性的策略 展開綜述。

ＤＮＡ （ 包 括 外 源 基 因 組 和 目 的 基 因 ） 和 載 體 分 子 切
開 （ 簡 稱 切 ） ； ２ ） 用 ＤＮＡ 連 接 酶 將 含 有 外 源 基 因 的

ＤＮＡ 片 段 接 到 載 體 分 子 上 ， 形 成 ＤＮＡ 重 組 分 子
（ 簡 稱 接 ） ； ３ ） 借 助 于 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 化 手 段 將 ＤＮＡ 重 組 分 子 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 中 （ 簡 稱 轉(zhuǎn) ） ； ４） 短 時 間 培 養(yǎng) 轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞 ， 以 擴(kuò) 增 ＤＮＡ 重 組 分 子 或 使 其 整 合 到 受 體 細(xì) 胞 的 基 因 組 中 （ 簡 稱 增 ） ； ５） 篩 選 和 鑒 定 轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞 ， 獲 得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞 （ 簡稱檢） 。作為現(xiàn)代生物工程的關(guān)鍵技術(shù)， 基因工 程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)， 基 因工程菌（ 細(xì)胞） 即是現(xiàn)代生物工程中的微型生物 反應(yīng)器。 用 于 重 組 ＤＮＡ 技 術(shù) 中 的 宿 主 細(xì) 胞 既 有 原 核 生 物， 又有真核生物， 典型的宿主細(xì)胞如： 大腸桿菌

１

質(zhì)粒不穩(wěn)定性的定義及類型
重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性， 是指重組菌在培養(yǎng)過程

中發(fā)生突變或丟失， 結(jié)果使重組菌失去了原有的表 型特征。依據(jù)重組質(zhì)粒的變化本質(zhì)， 質(zhì)粒不穩(wěn)定性 可分為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、 離不穩(wěn)定性。質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 分 不 穩(wěn) 定 主 要 是 由 于 ＤＮＡ 的 插 入 、 缺 失 或 重 排 等 引 起的不穩(wěn)定， 使目的基因功能丟失， 但對質(zhì)粒主要

收稿日期： ２００７－１２－１７ 作者簡介： 肖碩（ １９７４－ ） ， 女， 主管藥師， 在讀研究生， 研究方向： 農(nóng)業(yè)害蟲與生物防治 通訊作者： 洪華珠， 電子信箱： ｈｚｈｏｎｇ＠ｍａｉｌ．ｃｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

１０

生物技術(shù)通報(bào) Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ

２００８ 年第 ４ 期

遺 傳 標(biāo) 記 丟 失 影 響 較 小 ［１］。 質(zhì) 粒 的 分 離 不 穩(wěn) 定 是 細(xì) 胞在分裂后分離時引起的不穩(wěn)定， 由于質(zhì)粒在子代 細(xì)胞中的不均勻分配而使部分細(xì)胞不含質(zhì)粒， 是質(zhì) 粒丟失的主要原因。 粒的分離不穩(wěn)定性常出現(xiàn)在 質(zhì) 兩種情況， 一是傳代質(zhì)粒只在許多世代之后才明顯 產(chǎn)生丟失 ； 二是帶有質(zhì)粒的細(xì)胞與無質(zhì)粒細(xì)胞有 不 同 的 生 長 速 率 導(dǎo) 致 。 外 源 基 因 載 體 ＤＮＡ 的 存 在 猶如細(xì)胞內(nèi)存在多拷貝的質(zhì)粒一樣， 對宿主是一種 代謝負(fù)擔(dān)， 當(dāng)外源基因大量產(chǎn)生特異蛋白時， 這種 代謝壓力就變得更加嚴(yán)重。一般條件下， 帶有重組 質(zhì)粒的宿主菌的生長速率低于無質(zhì)粒的細(xì)菌， 由 此， 質(zhì)粒的穩(wěn)定性伴隨著生長速率的不同而變化。 基因重組菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大的 影響， 在連續(xù)培養(yǎng)時， 發(fā) 現(xiàn)在低比生長速率（ ０．３０２ｈ－１） 下 重 組 質(zhì) 粒 只 可 以 完 全 維 持 ２０ 代 。 Ｏ’ Ｋｅｎｎｅｄｙ 等 （ １９９５ ） 發(fā) 現(xiàn) ， 在 復(fù) 合 培 養(yǎng) 基 和 基 本 培 養(yǎng) 基 中 ， 重 組 釀酒酵母的質(zhì)粒穩(wěn)定性和比生長速率的關(guān)系不同。 在葡萄糖限制的復(fù)合培養(yǎng)基中， 質(zhì)粒丟失速率隨稀 釋率的增加而增大， 但是在葡萄糖限制的基本培養(yǎng) 基中則相反 。
［３］ ［２］

低影響質(zhì)粒穩(wěn)定性及人類特異性免疫反應(yīng)的降低 ［７］。

２．３

調(diào)控突變、 養(yǎng)條件等 培
外源基因的調(diào)控突變、 養(yǎng)條件及質(zhì)粒中所攜 培

帶的外源基因性質(zhì)、 組菌的生長速率、 源基因 重 外 的表達(dá)水平等因素都是影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素， 有 些需要在質(zhì)粒設(shè)計(jì)和構(gòu)建時仔細(xì)考慮， 有些則與培 養(yǎng)過程有關(guān)。

３
３．１

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的策略
質(zhì)粒的選擇
為了構(gòu)建穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)體， 最好利用小的質(zhì)粒，

小的質(zhì)粒在高密度發(fā)酵中遺傳性狀比較穩(wěn)定， 而大 的質(zhì)粒往往由于發(fā)酵環(huán)境中各種因素的影響， 而出 現(xiàn) 變 異 的 幾 率 較 高 ［３ ， ８］。 Ｋｉｍ 等 報(bào) 道 ， 用 穿 梭 質(zhì) 粒 克 隆 大 腸 桿 菌 ＤＮＡ 片 斷 ， 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 ， 重 組 質(zhì) 粒 能 穩(wěn) 定 地 傳 代 ； 而 轉(zhuǎn) 化 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ 后 ， 重 組 質(zhì) 粒 在 傳 代 過 程 中 發(fā) 生 分 離 ［９］。

３．２

選擇合適的插入片段或重新構(gòu)建表達(dá)載體

Ｂｉｏｎ 和 Ｌｕｘｅｎ 報(bào) 道 ， 插 入 ＤＮＡ 片 斷 的 大 小 ， 在
質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性中有關(guān)系。 們酶切同源和外源 他 染 色 體 ＤＮＡ， 得 到 大 小 不 同 的 片 斷 ， 與 穿 梭 質(zhì) 粒

２
２．１

質(zhì)粒不穩(wěn)定性的影響因素
宿主細(xì)胞的遺傳特性
重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性在很大程度上受宿主細(xì)胞

ｐｗＢ１１０ 重 組 。 得 到 兩 個 重 組 質(zhì) 粒 ｐＬＢ２ （ ３．６ｋｂ ） 和 ｐＬＢ５ （ ５．９ｋｂ ） ， 轉(zhuǎn) 入 枯 草 桿 菌 后 ， 重 組 質(zhì) 粒 的 穩(wěn) 定 性
表 現(xiàn) 出 和 插 入 ＤＮＡ 片 斷 大 小 有 關(guān) 。 而 轉(zhuǎn) 入 大 腸 桿 菌 ， 重 組 質(zhì) 粒 卻 不 表 現(xiàn) 出 這 種 相 關(guān) 性 ［３］。 趙 月 娥 等 對 人 ｔＰＡ 基 因 進(jìn) 了 重 建 ， 保 留 了 Ｆ 、 和 Ｐ 區(qū) 并 引 Ｇ 入 突 變 ， 構(gòu) 建 了 Ｋ１ ， Ｋ２ 區(qū) 缺 失 突 變 的 重 組 ｔＰＡ 質(zhì) 粒 ｐＱＥ３０ ， 并 在 大 腸 桿 菌 ＪＭ１０９ 菌 株 中 成 功 表 達(dá) 。 從 理 論 上 分 析 與 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 均 顯 示 ， 由 于 重 建 的 ｔＰＡｒ 基 因 的 ＤＮＡ 長 度 減 少 了 ４０％ ， 克 隆 并 導(dǎo) 入 宿 主 菌 后 ， 具 有 更 高 的 遺 傳 穩(wěn) 定 性 ［１２］。

遺傳特性的影響。相對而言， 重組質(zhì)粒在大腸桿菌 中比較穩(wěn)定， 在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定， 但是 也 有 例 外 。黃 立 志 等 發(fā) 現(xiàn) 外 源 ＮＫ 基 因 的 導(dǎo) 入 對 宿 主 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ 與 ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ＧＳ１１５ＤＥ 生 長 沒 有 明 顯 影 響 ， 重 組 質(zhì) 粒 Ｐｂｖ２２０－ＮＫ 在 大 腸 桿 菌 中 結(jié) 構(gòu) 穩(wěn)定性有待提高， 而在畢赤酵母中穩(wěn)定性很好 。
［４］

２．２

質(zhì)粒的特性
在重組菌細(xì)胞中， 質(zhì)粒載體的大小與拷貝數(shù)是

ｐａｒＤＥ 基 因 的 插 入 ， 可 提 高 重 組 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 。
莫 志 偉 等 將 ｐａｒＤＥ 基 因 插 入 到 ｐＳＴ１０２１ 等 質(zhì) 粒 上 可以提高重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性， 提高基因工程菌 的 應(yīng) 用 效 果 ［１０］。趙 立 平 等 也 利 用 ＲＫ２ 質(zhì) 粒 的 ｐａｒＤＥ 片段提高重組質(zhì)粒在生防菌成團(tuán)泛菌中的穩(wěn)定 性 ［１１］ 。

影 響 質(zhì) 粒 分 離 不 穩(wěn) 定 的 重 要 因 素 。 插 入 ＤＮＡ 片 段 的大小及特性等在質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性中有關(guān)系， 一 般小的片段 質(zhì)粒比較穩(wěn)定 。對于松 弛型質(zhì)粒載體， 一般情況下， 伴隨著細(xì)胞分裂， 質(zhì)粒以隨機(jī)方式分 配到子粒細(xì)胞中， 質(zhì)粒拷貝數(shù)越高， 出現(xiàn)無質(zhì)粒載 體細(xì)胞的概率就越低， 質(zhì)粒就越穩(wěn)定， 而質(zhì)粒載體 的寡聚化效應(yīng)會導(dǎo)致質(zhì)粒載體拷貝數(shù)大大降低， 從 而 加 重 質(zhì) 粒 的 分 離 不 穩(wěn) 定 性 ［５ ， ６］。 Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｅ．Ｇａｈａｎ 等 研 究 發(fā) 現(xiàn) 口 腔 減 毒 疫 苗 菌 株 ＢＲＤ 質(zhì) 粒 拷 貝 數(shù) 降
［３］

３．３

選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞
重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性在很大程度上受宿主細(xì)胞

遺傳特性的影響。相對而言， 重組質(zhì)粒在大腸桿菌 中比較穩(wěn)定， 在枯草桿菌和酵母中較不穩(wěn)定， 但是

２００８ 年第 ４ 期

肖碩等： 基因工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性研究進(jìn)展

１１

也 有 例 外 ［４］。 同 一 宿 主 菌 株 對 不 同 質(zhì) 粒 的 穩(wěn) 定 性 不 同， 而同一質(zhì)粒在不同宿主菌株中的穩(wěn)定性也有差 別。因此對于不同的表達(dá)系統(tǒng)、 源基因表達(dá)產(chǎn)物 外 的性質(zhì)、 達(dá)產(chǎn)物是否需要進(jìn)行后加工及其復(fù)雜程 表 度將決定宿主菌的選擇， 如真核或原核生物、 白 蛋 酶缺陷型或營養(yǎng)缺陷型等的宿主菌。

拌速率適于保存質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在攪拌罐發(fā)酵時， 質(zhì)�？截悢�(shù)通常比搖瓶培養(yǎng)低， 原因是攪拌罐中有 較好通氣， 生長速率較高， 染色體復(fù)制增加， 當(dāng)溶解 氧強(qiáng)度在非選擇性培養(yǎng)基中周期變化時， 重組酵母 連續(xù)培養(yǎng)質(zhì)粒穩(wěn)定性強(qiáng)烈依賴于培養(yǎng)的生長速率， 在較低生長速率下完全穩(wěn)定， 提高氧壓力或增加氧 濃度能引起細(xì)胞內(nèi)氧化性脅迫， 而過渡或穩(wěn)定階段 缺 氧 條 件 引 起 氨 基 酸 生 產(chǎn) 和 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 受 限 制 ［１５］。

３．４

添加選擇壓力
重組菌的穩(wěn)定性受遺傳及環(huán)境因素兩方面的

控制， 所以可以通過基因水平的控制來限制反應(yīng)器 中無質(zhì)粒細(xì)胞的繁殖以提高系統(tǒng)中含質(zhì)粒細(xì)胞的 比例。在重組菌培養(yǎng)過程中通常采用增加“ 擇壓 選 力” 提高重組菌的穩(wěn)定性。 選擇壓力” 常包括： 來 “ 通

３．５．３

溫 度 和 ｐＨ

有的質(zhì)粒屬溫度敏感型質(zhì)粒，

如 農(nóng) 桿 菌 質(zhì) 粒 ， 當(dāng) 農(nóng) 桿 菌 培 養(yǎng) 溫 度 超 過 ３０℃， 即 引 起 質(zhì) 粒 丟 失 ［１６］； Ｋｗａｎｇ Ｈ． Ｓｏｎ 等 也 發(fā) 現(xiàn) 培 養(yǎng) 溫 度 處 于 ３０℃～ ４４℃時 ， 巨 大 芽 孢 桿 菌 ＰＣＫ１０８ 質(zhì) 粒 結(jié) 構(gòu) —— 基 本 穩(wěn) 定 ， 而 且 其 目 的 產(chǎn) 物 —纖 維 素 酶 產(chǎn) 量 比

１） 在 質(zhì) 粒 構(gòu) 建 時 ， 加 入 抗 生 素 抗 性 基 因 ， 在 生 物 反
應(yīng)器的培養(yǎng)基中 加入抗生素 以 抑 制 無 質(zhì) 粒 細(xì) 胞 （ Ｐ－ ） 的 生 長 和 繁 殖 ； ２） 利 用 營 養(yǎng) 缺 陷 型 細(xì) 胞 作 為 宿 主 細(xì) 胞， 構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)質(zhì)粒， 設(shè)計(jì)營養(yǎng)缺陷型培 養(yǎng) 基 抑 制 無 質(zhì) 粒 細(xì) 胞 （ Ｐ－ ） 的 生 長 和 繁 殖 ； ３ ） 噬 菌 體 抑制及轉(zhuǎn)化子中自殺蛋白的表達(dá)， 在含“ 擇壓” 選 的 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) 基 因 工 程 菌 可 以 有 效 地 抑 制 （ Ｐ－ ） 細(xì) 胞的生長和繁殖， 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。這種方法對于 質(zhì)�；蛩拗骷�(xì)胞本身發(fā)生了突變， 雖保留了選擇性 標(biāo)記、 不能表達(dá)目的產(chǎn)物的細(xì)胞無效。史悅等發(fā) 但 現(xiàn) 質(zhì) 粒 ＰＥＴＮＨＭ 在 無 抗 生 素 選 擇 壓 力 下 ， 連 續(xù) 傳 代 ４８ 代 后 質(zhì) 粒 丟 失 的 無 質(zhì) 粒 細(xì) 胞 開 始 出 現(xiàn) ， 進(jìn) 一 步研究表明， 卡拉霉素的選擇壓力能夠保證質(zhì)粒的 穩(wěn)定遺傳 。
［５］

３０℃時 顯 著 提 高 ， 但 ３０℃時 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 較 強(qiáng) ［１７］。 對
于溫度敏感型質(zhì)粒， 為了控制在生長前期其外源基 因不表達(dá)， 一般采用二階段溫度培養(yǎng)系統(tǒng)， 即在菌 體生長階段， 采用較低的培養(yǎng)溫度， 當(dāng)菌體生長至 適宜濃度和生長時期時， 提高溫度進(jìn)行誘導(dǎo)， 使外 源基因表達(dá)。與一般微生物發(fā)酵相似， 重組工程菌 的 生 長 和 產(chǎn) 物 合 成 時 的 ｐＨ 值 往 往 不 同 ， 如 重 組 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ （ ｐＩＬ２５２ ） 對 生 長 和 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 的 最 適 ｐＨ 值 分 別 為 ６．３９ 和 ６．４１ ［１８］。

３．５．４ ３．５．４．１

選擇合適的培養(yǎng)操作方式 適當(dāng)采用流加操作方式 不同流加方式

對質(zhì)粒的穩(wěn)定性影響也較大。 研究生產(chǎn)重組葡聚 在 糖酶的枯草桿菌質(zhì)粒穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)， 周期性分批流 加的酶產(chǎn)量和質(zhì)粒穩(wěn)定性高于間歇培養(yǎng)和恒化器 培 養(yǎng) ， 周 期 ２～ ， 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 ； 大 于 ６ｈ ， 質(zhì) 粒 丟 失 增 ４ｈ 多， 而間歇性培養(yǎng)和恒化器培養(yǎng)時質(zhì)粒很快丟失 ［１９］。 另外， 選擇合適的流加方式可提高質(zhì)粒在非選擇性 培 養(yǎng) 基 中 的 穩(wěn) 定 性 和 工 程 菌 的 產(chǎn) 量 ［２０］。

３．５ 控 制 培 養(yǎng) 條 件 ３．５．１ 培 養(yǎng) 基 組 成 培 養(yǎng) 基 組 成 成 分 及 其 比 例 對 質(zhì) 粒 的 穩(wěn) 定 性 影 響 較 大 ， Ｊｏｎｅｓ 和 Ｍｅｌｌｉｎｇ 研 究 了 連 續(xù) 培 養(yǎng) 中 Ｅ．ｃｏｌｉ 中 幾 種 質(zhì) 粒 的 穩(wěn) 定 性 ， 分 別 以 葡 萄
糖、磷酸鹽和無機(jī)鹽作為限制性基質(zhì)， 發(fā)現(xiàn)除

ｐＢＲ３２５ 外 的 大 部 分 質(zhì) 粒 在 以 磷 酸 鹽 為 限 制 性 基 質(zhì)
時很快丟失
［１３］

３．５．４．２

連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)的方式很多， 一種選

。 周 宇 荀 等 也 發(fā) 現(xiàn) 抗 菌 肽 基 因 Ａｄｅｎｏ
［１４］

擇性循環(huán)反應(yīng)器在連續(xù)培養(yǎng)過程中采用誘導(dǎo)方法 使含質(zhì)粒細(xì)胞在分離器中絮凝， 而細(xì)胞生長和產(chǎn)物 合成在主發(fā)酵罐中進(jìn)行， 循環(huán)過程將目的菌株（ 含 質(zhì)粒菌株） 和非目的菌株（ 不含質(zhì)�；螂s菌） 分開， 富集重組菌或生產(chǎn)菌， 能使含質(zhì)粒細(xì)胞占優(yōu)勢并能 高速合成外源蛋白。 續(xù)培養(yǎng)的稀釋速率對質(zhì)粒穩(wěn) 連 定 性 有 顯 著 影 響 。 對 含 重 組 質(zhì) 粒 ＰＬＧ６６９－２ 的 釀 酒 酵母研究發(fā)現(xiàn)， 稀釋速率周期變化時， 周期的振幅

ｒｅｇｕｌｉｎ （ ＡＤＲ ） 培 養(yǎng) 基 中 適 當(dāng) 加 入 葡 萄 糖 ， 對 質(zhì) 粒 的
穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)量有重要作用 。

３．５．２

氧傳遞和攪拌

對固定化重組工程菌菌培

養(yǎng)來說， 氧傳遞受固定化膠粒屏障和膠粒表面高濃 度細(xì)胞的限制， 攪拌速率影響著培養(yǎng)液內(nèi)的氧供應(yīng) 和對菌體的剪切力， 強(qiáng)烈攪拌使固定化膠粒內(nèi)細(xì)胞 濃度明顯減少， 質(zhì)粒穩(wěn)定性也顯著降低， 溫和的攪

１２

生物技術(shù)通報(bào) Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ

２００８ 年第 ４ 期

和 頻 率 是 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 的 重 要 參 數(shù) ［２１］。

的效果。 著基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步 隨 發(fā)展， 將會從根本上解決基因工程菌中質(zhì)粒穩(wěn)定性 的問題， 為外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)提供堅(jiān)實(shí)的基 礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)

３．５．４．３

固定化培養(yǎng)

細(xì)胞固定化是在固定化酶

技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的， 細(xì)胞的固定化方法可以 分為吸附法、 埋法、 聯(lián)法及共價法等。 于大部 包 交 由 分細(xì)胞在固定化后仍可以保持生長繁殖能力， 因 此， 大多數(shù)研究工作都集中在吸附法和包埋法。固 定化細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是： 細(xì)胞 可以重復(fù)或連續(xù)使 用， 可以提高生產(chǎn)效率； 另外， 細(xì)胞固定化后， 可以 為細(xì)胞創(chuàng)造一個適宜的局部環(huán)境 （ 如溫度、 、 ｐＨ 剪 切力等） ， 有利于細(xì)胞的生長和產(chǎn)物表達(dá)。 于基因 對 工程菌而言，， 相對于游離細(xì)胞懸浮培養(yǎng)， 固定化細(xì) 胞培養(yǎng)可以有效克服或減少質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象， 特別 用非選擇性培養(yǎng)基時， 固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可提高 反應(yīng)器產(chǎn)率， 得到高細(xì)胞濃度和高產(chǎn)物。在固定化 細(xì)胞培養(yǎng)體系中， 重組質(zhì)粒穩(wěn)定性得到提高， 但其 機(jī) 理 還 不 是 很 清 楚 ， 主 要 原 因 可 能 有 ： ｌ） 固 定 化 細(xì) 胞 的 生 長 速 率 下 降 ； ２） 細(xì) 胞 的 區(qū) 域 化 分 布 ； ３） 固 定 化材料的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)影響質(zhì)粒穩(wěn)定性， 使 得質(zhì)粒 的分離不穩(wěn)定性得到 改善， 不含質(zhì)粒細(xì)胞 的 生 長 優(yōu) 勢 減 少 ， 使 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 高 于 游 離 細(xì) 胞 培 養(yǎng) ［６］。 在細(xì)胞固定化方法及固定化細(xì)胞反應(yīng)器的研究中， 應(yīng)該注意盡可能地應(yīng)用最簡單的固定化方法及與 其相匹配的最優(yōu)生物反應(yīng)器。中空纖維反應(yīng)器、 固 定床反應(yīng)器、 相流化床反應(yīng)器等就是其中的典型 三 例子， 這些反應(yīng)器有些己經(jīng)工業(yè)化應(yīng)用， 有些還處 于實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)化實(shí)驗(yàn)研究階段。

１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０ ２１

Ｓｅｏ ＪＨ ， Ｂａｉｌｅ ＪＥ．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， １９８５ ， ２７：１６８８￣１６７５．
邱 曉 穎 ， 朱 紅 惠 ， 盧 秋 雁 ， 等 ． 高 技 術(shù) 通 訊 ， １９９８ ， ６ ： ５２￣５５． 夏 詔 杰． 提 高 重 組 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 和 蛋 白 質(zhì) 產(chǎn) 率 的 培 養(yǎng) 策 略 研 究

［碩 士 論 文 ］． 西 安 ： 西 北 大 學(xué) ， ２００２ ， ３￣４．
黃 志 立 ， 羅 立 新 ， 楊 汝 德 ， 等 ． 廣 東 藥 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) ， ２００１ ， １７ ４） ． （ 史 悅 ， 于 慧 敏 ， 田 卓 玲 ， 等 ． 中 國 生 物 工 程 雜 志 ， ２００５ ， ２５ ８） ： （

７０～７５． Ｃｌａｉｒｅ Ｂａｌｄｉｎｇ， Ｉａｎ Ｂｌａｂｙ， Ｄａｖｉｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ．Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｏｌｕｍｅ ， ２００６ ， ５６：６８￣７３． Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｅ， Ｇａｈａｎ， Ｄｉａｎｅ Ｅ． Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｓｔｅｖｅｎ Ｌ． Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇｈ， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２００７ ， ２５ ： １４７６￣１４８３．
陸 國 謹(jǐn) ． 北 京 輕 工 業(yè) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) ， １９９５ ， １３ ２） ： ４０￣４３． （

Ｋｉｍ ＳＨ ， Ｒｙｕ ＤＤＹ．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１９８４，２６：４９７￣５０２．
莫 志 偉 ， 張 燕 ， 張 紫 萊 ， 等 ． 應(yīng) 用 與 環(huán) 境 生 物 學(xué) 報(bào) ， ２００２ ， ８ ５） ： （

５２８～５３１．
趙 立 平 ， 張 麗 ， 李 艷 琴 ， 等 ． 中 國 生 物 防 治 ， １９９９ ， １５ ２） ： ４９～ （

５３．
賀 石 漢 ． 武 漢 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 理 學(xué) 版） ， ２００３ ， ４９ ４） ： ４９７￣５００． （ （ 陳 新 愛 ． 基 因 工 程 菌 培 養(yǎng) 若 干 重 要 問 題 的 研 究 ［博 士 學(xué) 位 論 文 ］． 杭 州 ： 浙 江 大 學(xué) ， ２００２． 周 宇 荀 ， 曹 巍 ， 魏 東 芝 ， 等 ． 生 物 工 程 學(xué) 報(bào) ， ２００５ ， ７ ４） ２１． （ （ Ｋｏｎｇ ＪＯ， Ｋｉｎｇ Ｊ ， Ｃｏｏｎｅｙ ＣＬ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ， １９９８ ， １４ ３） ：

３９３～４０９．
林 棲 鳳 ． 植 物 分 子 育 種 ． 北 京 ： 科 學(xué) 出 版 社 ， ２００４ ， ２２３￣２５９．

４

存在的問題及展望
雖然提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究有了很多成功實(shí)

Ｋｗａｎｇ Ｈ Ｓｏｎ１ ， Ｊｏｎｇ Ｈ Ｊａｎｇ１ ， Ｊｕｎｇ Ｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７ ， ９ ： ８２１￣８２４．
（ Ｂｅａｌ Ｃ， Ｄ＇Ａｎｇｉｏ Ｃ， Ｃｏｒｒｉｅｕ Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ， １９９８ ， ２０ ７） ：

例， 但因基因工程菌的培養(yǎng)與發(fā)酵受諸多因素與條 件的影響， 而且隨機(jī)性和可變性大， 要在實(shí)驗(yàn)條件 下使基因工程菌的質(zhì)粒保持穩(wěn)定的遺傳性狀， 仍存 在各種工程問題有待于解決。 于基因工程菌的多 由 樣性， 所采用的手段常缺乏通用性， 研究的特定體 系， 一般要采取具有針對性的措施， 才能獲得較好

６７９～６８２．
（ Ａｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ， Ｌｙｎｃｈ ＨＣ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９７ ， ５６ １） ：

２３～３１．
劉 志 偉 ， 郭 勇 ． 微 生 物 學(xué) 通 報(bào) ， ２００１ ， ２８ ２） ： ８６￣８９． （

Ｋｈａｓａｒ Ｓ， Ｐａｕｌ ＦＧ， Ｄａｖｉｄ ＡＭ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９６ ，
（ ４５ ３） ２０５～２１０．



  本文關(guān)鍵詞：基因工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。