本文關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

第29卷　第8期　　陳　穎等:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法的建立

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法的建立

陳　穎1　徐寶梁1　蘇　寧1　王　媛2　王丙武1　葛毅強(qiáng)3

3

1(中國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所,北京,100025)　2(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,北京,100049)

3(科技部中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心,北京)

綜

述與專題評論

摘　要　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),,LectinEPSPS公司生產(chǎn)的商

該方法的檢測靈敏度<0101%,是

100倍。熒光定量PCR,轉(zhuǎn)基因大豆,轉(zhuǎn)基因檢測

　　隨著近年來人們對轉(zhuǎn)基因作物安全性的日益重視,對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法的研究發(fā)展十分迅速,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性檢測技術(shù)已由篩選檢測深入為對目的基因的特異性檢測。與此同時(shí),隨著各國有關(guān)GMO(geneti2callymodifiedorganism)標(biāo)簽法的建立和不斷完善,轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確定量檢測也顯得日趨重要,很多國家不但要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測,還需要對產(chǎn)品中的GMO含量進(jìn)行定量檢測,以便標(biāo)識。挪威是世界上第一個(gè)要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行含量標(biāo)識的國家,該國對轉(zhuǎn)基因的限量為2%[1];歐盟和瑞士規(guī)定食品中GMO成分超過1%則必須進(jìn)行標(biāo)識;日本的限量標(biāo)識為5%[2,3]。

目前,定量PCR檢測方法是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量標(biāo)識的主要方法。但傳統(tǒng)PCR定量方法如內(nèi)參照法、競爭法和PCR2ELISA法都是終點(diǎn)檢測,即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測,PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時(shí),檢測重現(xiàn)性較差。因此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real2timefluorescencequantitativePCRdetection)是近幾年興起的分子生物學(xué)檢測技術(shù),于1996年由美國Ap2pliedBiosystems公司推出。與常規(guī)PCR相

　第一作者:博士,高級工程師。3科技部社會公益研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目　收稿時(shí)間:2003-04-14,改回時(shí)間:2003-07-07

比,該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR

從定性到定量的飛躍,而且,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR

污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR多一個(gè)寡聚核苷酸探針,該探針與摸板特異性結(jié)合,并帶有一個(gè)熒光發(fā)光分子和一個(gè)熒光淬滅分子,完整的探針在激光激發(fā)下,發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光被淬滅分子全部吸收,樣品無熒光,而PCR擴(kuò)增過程中,Taq酶分子在鏈延長的過程中可以通過自身的5’23’核酸外切酶降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針,使得熒光發(fā)光分子從探針上切下來而與熒光淬滅分子分開,從而在激光激發(fā)下產(chǎn)生特定波長的熒光,模板每復(fù)制一次,就有一個(gè)探針被切斷,伴隨一個(gè)熒光信號的釋放。所以熒光信號的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系,因此用該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

本文通過應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對Roundup2Ready大豆的檢測,旨在建立一種簡便、快速的大豆食品轉(zhuǎn)基因成分及含量的檢測方法,為我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

65

綜述與專題評論

食品與發(fā)酵工業(yè)　　FoodandFermentationIndustries　　Vol129　No18

1　材料與方法

111　實(shí)驗(yàn)材料11111　樣　品

11211　DNA的提取

按DNA試劑盒所述方法提取樣品

DNA,經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度后,將其稀釋為終濃度50ng/μL,備用。11212　PCR轉(zhuǎn)基因成分含量分別為5%、2%、1%、

015%、011%、0%的轉(zhuǎn)基因大豆RoundupReady標(biāo)準(zhǔn)品購自Fluka公司(Switzerland)11111

μL,其中L,脫氧核苷酸三磷酸TP(10mmol/L)2μL,引物(20μmol/L)各1μL,模板DNA(50ng/μL)2μL,Taq聚合酶2U,擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃3min;變性94℃45s,退火60℃30s,延伸72℃1min,后

TaqManUni2

versalPCRMasterMix購自美國ABI公司;DNA提取試劑盒WizardGenomicDNAPu2rificationKit購自美國Promega公司。11113　主要儀器與設(shè)備

離心機(jī),渦旋振蕩器,恒溫箱,核酸蛋白分析儀(BIO2RAD),定量PCR儀(ABI7700)。112　實(shí)驗(yàn)方法

延伸72℃7min,35個(gè)循環(huán)。

11213　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測1121311　擴(kuò)增用引物

定量檢測所用引物[4]、探針均由上海生工公司合成(見表1)。

擴(kuò)增產(chǎn)物長度

()

118

表1　轉(zhuǎn)基因大豆定量PCR擴(kuò)增所用引物和探針

基因名稱

Lectin

基因性質(zhì)內(nèi)　源

引物/探針序列

5’2ctcttcccgagtgggtgagga23’5’2cgattccccaggtatgtcga23’

5’2tgatgtgatatctccactgacg23’5’-tgtatcccttgagccatgttgt23’

CP4EPSPS外　源172

1121312　擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增采用ABI公司提供的試劑盒,反應(yīng)體系見表2。擴(kuò)增反應(yīng)采用2

步法,具體條件為預(yù)變性95℃10min。擴(kuò)增95℃20s,60℃1min,40個(gè)循環(huán)。

表2　ABI試劑盒定量擴(kuò)增體系

試劑名稱

MasterMix

Ready轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品(5%、2%、1%、015%、011%、0%)的測定,計(jì)算機(jī)自動生成

貯備液濃度

-

加入PCR反應(yīng)體系的體積/μL

10

引　物

探　針模板DNA

水

μmol/L20μmol/L10

50ng/μL

-

各015

12

補(bǔ)足至總體積為25

11214　定量PCR結(jié)果計(jì)算1

121411　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的Roundup66

標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)為臨界循環(huán)值Ct,橫坐標(biāo)

為百分含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計(jì)算公式,將樣品的Ct值代入公式,即可得到待測樣品的轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。1121412　檢測低限的測定

為測定該方法對轉(zhuǎn)基因大豆檢測的檢測低限,取011%的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品20mg,0%的標(biāo)準(zhǔn)品20mg,充分混勻,得到0105%的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品;取011%的標(biāo)準(zhǔn)品4mg,0%的標(biāo)準(zhǔn)品36mg,充分混勻,得到0101%的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品。擴(kuò)增從015%、011%、0105%與0101%標(biāo)準(zhǔn)品中提取的DNA,得到相應(yīng)的Ct值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷定量檢測轉(zhuǎn)基因大豆的檢測低限。

第29卷　第8期　　陳　穎等:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法的建立

1121413　檢測方法精密度分析

用已知轉(zhuǎn)基因成分含量為2%、015%、

0105%的大豆標(biāo)準(zhǔn)品樣品,重復(fù)檢測10次。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到被檢測樣品的轉(zhuǎn)基因百分含量。通過對所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,如標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等,評價(jià)本檢測方法的精密度。

標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=

(2+-n-和臨界循環(huán)值(Ct,cyclethreshold)均可反映擴(kuò)增的效果。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(Rn)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明,Ct值與該模板的起始拷貝[6],Ct,模板,模板C<時(shí),即

綜述與專題評論

CV)SD/X×100%

其中:d1～dn為樣品1～n次測量所得轉(zhuǎn)基因成分含量,%;X為樣品1～n次測量所得轉(zhuǎn)基因成分的算術(shù)平均值,%;n為樣品測量次數(shù);SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差。1121414　檢測回收率計(jì)算

回收率/%=C1/C2×100%其中:C1———樣品測量所得轉(zhuǎn)基因成分含量的平均值;C2———被測樣品的實(shí)際轉(zhuǎn)基因成分含量。

,。由于模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在的線性關(guān)系,因此利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品即可作出該線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表已知濃度的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。

用不同轉(zhuǎn)基因含量的RoundupReady轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品對轉(zhuǎn)入的外源CP4EPSPS基因[7]進(jìn)行定量檢測,以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。通過Ct值檢測軟件自動生成以Ct值為縱坐標(biāo),以百分含量的對數(shù)為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,所測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為Y=-31176X+261006,相關(guān)系數(shù)

R2為01991。這樣,將待測樣品擴(kuò)增得到的Ct值

(Y值)代入公式,即可得到待測樣品的轉(zhuǎn)基

2結(jié)果與分析

211　大豆內(nèi)源Lectin基因定性

提取出一定數(shù)量的高質(zhì)量DNA是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測的前提條件。通過檢測內(nèi)源特異參照基因(內(nèi)源基因),可以判定DNA是否被提取出來,或所提DNA是否適合于進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而可以避免檢測結(jié)果的假陰性。因此,對大豆內(nèi)源基因Lectin[5]的檢測即是對被檢測樣品DNA提取質(zhì)量的檢測。

本研究通過采用特異引物首先對轉(zhuǎn)基因大豆中的內(nèi)源基因進(jìn)行了定性PCR檢測,以確定所提取的DNA是否適合于PCR擴(kuò)增。PCR電泳顯示:轉(zhuǎn)基因成分含量分別為5%、2%、1%、015%、011%、0%的轉(zhuǎn)基因大豆,均擴(kuò)增出了118bp片斷(電泳結(jié)果未顯示),該結(jié)果表明,所提取的DNA數(shù)量和質(zhì)量均適合于PCR擴(kuò)增。212　標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在定量檢測中標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告熒光信號(Rn)

因成分的百分含量。

圖1　轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品外源

CP4EPSPS基因量擴(kuò)增結(jié)果

213　檢測靈敏度

在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測中,檢測

靈敏度即所謂的檢測低限通常有3種表示方法:絕對檢測低限(能被檢測和定量到的模板起始拷貝最低數(shù))、相對檢測低限(能被檢測和定量到的外源基因的最低百分含量)、實(shí)際檢測低限(實(shí)際被檢測的DNA數(shù)量)。實(shí)時(shí)

67

綜述與專題評論

食品與發(fā)酵工業(yè)　　FoodandFermentationIndustries　　Vol129　No18

熒光PCR檢測的靈敏度主要取決于以下3

方面:用于PCR反應(yīng)的DNA總量;被檢測作物品種的基因組大小;每個(gè)基因組中所含外源基因的數(shù)目,即外源基因的拷貝數(shù)[8]。

本研究中采用相對檢測低限測定轉(zhuǎn)基因大豆Roundup2Ready的檢測靈敏度。通過從不同濃度的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品中提出DNA進(jìn)行CP4明,轉(zhuǎn)2的CP40101%(見圖2)。低標(biāo)識限量的100倍,已經(jīng)完全能滿足轉(zhuǎn)基因檢測的需要。

續(xù)表3

轉(zhuǎn)基因成分檢測值/010501501052301492101054201501901052801513501004101177351601%210211205118829210672011328136

910

平均值

)

1)

CV//1),標(biāo)準(zhǔn)偏差;2)CV:Coeffi2

ofVariation,變異系數(shù)。

　　從表3中可知,轉(zhuǎn)基因成分含量為

0105%、015%和2%的3種樣品的測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為017735%、318559%和614233%,其回收率分別為105150%、10217%、103136%,說明此方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

3　結(jié)論與討論

311　引物和探針的設(shè)計(jì)

圖2　轉(zhuǎn)基因大豆外源CP4EPSPS基因定量

檢測靈敏度測定

214　檢測精密度

為確證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性,本實(shí)驗(yàn)選取了轉(zhuǎn)基因成分含量為0105%、015%和2%的3種樣品進(jìn)行了n=10次的測定,并通

過統(tǒng)計(jì)分析得到了采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

方法的精密度(如表3所示)。

表3　轉(zhuǎn)基因大豆定量檢測方法精密度

轉(zhuǎn)基因成分檢測值/

01050150105110151130104790154900105280148270

10492015053010573015132010612015179010533015235010486015371

%210210124211127118936211513211682213146119843210311

12345678

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測中引物和探針的設(shè)

計(jì)是PCR擴(kuò)增獲得成功的關(guān)鍵之一。在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)應(yīng)盡量遵循以下原則:引物要在探針確定以后再選擇,并盡可能地與探針接近,但不要重疊。保持GC含量在30%～80%之間,但要避免同一堿基重復(fù)過多,特別是G,不可超過4個(gè);在引物中3’末端的5個(gè)堿基中G和(或)C的總數(shù)不能超過2個(gè),在探針中5’末端的第一個(gè)堿基不能是G;無論引物還是探針Tm一般應(yīng)當(dāng)在58～60℃之間較為合適。

為了能有效檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,通過文獻(xiàn)研究[9,10],設(shè)計(jì)采用了引物與探針的最佳組合,使PCR反應(yīng)效率高,靈敏度高,重現(xiàn)性好。312　檢測精確度和靈敏度的測定

定量實(shí)驗(yàn),誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,可以將誤差降低到最小。本研究中通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定了該方法的檢測精密度,所測數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)(顯著性水平α=0105)分析表明,該方法所測數(shù)據(jù)合理。

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第29卷　第8期　　陳　穎等:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法的建立

通過轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品和非轉(zhuǎn)基因大豆

樣品的混合,測定了該方法對轉(zhuǎn)基因大豆檢測的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的靈敏度小于0101%�？紤]到國際上目前設(shè)定的轉(zhuǎn)基因限量是本方法檢測靈敏度的100倍,本研究認(rèn)為0101%的要。

參

獻(xiàn)

1　MayerR1FoodControl,1999,10:391～3992　SwissFederalOfficeofPublcHealthDepartmentof

FoodScienceCH23003Bern,Swizerland.Ei2dgenossischeDrucksachenundMaterialzentrale.1995,R817.02.

3　ECRegulation1998/11391Councilregulation

(EC)No1139/98of26May1998Concerningthe

CompulsoryIndicationoftheLabellingofCertainFoodstuffsProducedfromGeneticallyModifiedOr2ganismsofParticularsotherthanThoseProvidedforinD79/112/EEC1Brussels,Belgium1L159:4～7

4　JankiewiczA,BrollH,ZagonJ1Res

,,209:82

5　R1Cell,

,:1～1　Cal1Biotechnology,1993,

11(:1026～1030

7　BarryGF,KishoreGM,PadgetteSetal1

Glyphosate2tolerant52Enolpyruvateshikimate232PhosphateSynthases,U1S1Patent,56270612A9.1997

8　HubnerP,WaiblingerHU,PietschKJ.AOAC

Int,2001,84:1855～1846

9　VaitilingomM,PijnenburgH,GendreFetal,J

AgricFoodChem,1999,47:5261～5266

10　KnutGB,ArneHJ.EurFoodResTechnol,

2001,213:432～438

綜述與專題評論

Real2timeQuantitativePolymeraseChainReaction

MethodsforGeneticallyModifiedSoybeanChenYing1　XuBaoliang1　SuNing1

WangYuan2　WangBingwu1　GeYiqiang3

1(ChinaImportandExportCommodityInspectionTechnologyInstitute,Beijing,100025)

2(ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100094)

3(ChinaAgriculturalTechnologyDevelopmentCentral,Beijing,100045)

ABSTRACT　Aquantitativemethodwasdevelopedtodetecttransgenic“Roundup2Ready”soy2bean(Monsanto)byreal2timequantitativePCR1SpecialprimersandprobeswereusedtoamplifytheendogenousgenelectinandexogenousgeneCP4EPSPS1Thedetectionlimitofthismethodwas0101%whichwas100timeslowerthanthelowestinternationallabelingthreshold1Thesta2tisticalanalysisshowedthattheaccuracyandprecisionofthismethodwasinagreementwithoth2erquantitativeGMOdetectionsystems1Keywords　real2timequantitativePCR,“Roundup2Ready”soybean,GMO

detection

信息窗

吃適量的巧克力有助于心臟健康

美國加里福尼亞大學(xué)的研究人員指出:富含黃酮醇的巧克力與改善血管功能之間有著某種潛在的聯(lián)系。從醫(yī)學(xué)角度來講,血管功能、膽固醇含量及血壓都是心血管健康的重要指標(biāo)。21名健康人參加該實(shí)驗(yàn),他們被隨機(jī)分為2組,每天分別吃下46g富含黃酮醇(約含259mg黃酮醇)和不含黃酮醇的巧克力。2周后當(dāng)研究人員化驗(yàn)他們血液中黃酮醇含量時(shí),發(fā)現(xiàn)巧克力中的黃酮醇均被吸收到血液中。

黃酮醇對健康有益的研究結(jié)果還有以下幾點(diǎn):(1)黃酮醇能放松血管周圍的肌肉,使血流順暢;(2)黃酮醇能維持或增強(qiáng)氮氧化合物在血管功能中的效用;(3)黃酮醇對于血小板(起凝血作用)能產(chǎn)生一種類似于阿斯匹林的效用。研究人員認(rèn)為,只要量適當(dāng),每天吃一些巧克力還是有益于身體健康的。

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