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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細(xì)胞絮凝的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《大連理工大學(xué)》 2013年

轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細(xì)胞絮凝的研究

郭鎖蓮  

【摘要】：微藻可以用于CO2減排、污水處理和生物能源生產(chǎn),對社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。但由于微藻細(xì)胞個體小,表面攜帶電荷以及培養(yǎng)濃度低等特點,使得微藻采收成本高居不下。理想的微藻不但應(yīng)有良好的經(jīng)濟價值,最好還具有細(xì)胞絮凝能力,利用其細(xì)胞絮凝特性進行采收,會大大降低采收成本。 斜生柵藻不但可以作為飼料餌料,也可用于水體修復(fù),還可用于生物柴油生產(chǎn)。但目前國內(nèi)外對其分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究還很少,缺少高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。本文以斜生柵藻FSP-3為實驗材料,建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,實現(xiàn)了酵母絮凝基因的成功表達,并證明了酵母絮凝基因可賦予柵藻細(xì)胞絮凝的特性。此外,還研究了天然自絮凝柵藻AS-6-1的細(xì)胞自絮凝特性,探討了細(xì)胞自絮凝機理,研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 首先,對實驗藻株進行無菌處理,這是進行微藻生理、生化以及遺傳學(xué)研究的關(guān)鍵和前提。通過離心洗滌和稀釋平板法除去藻液中的霉菌,再利用溶菌酶/SDS并結(jié)合抗生素法除藻液中的細(xì)菌,通過鏡檢及無菌檢驗,未見有細(xì)菌或霉菌存在,證明有效地去除了斜生柵藻FSP-3和AS-6-1中的雜菌,為后續(xù)研究工作提供了可靠的實驗材料。在此基礎(chǔ)上,對獲得的無菌藻株進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,分別考察了接種量、溫度、表面光照強度及初始pH對藻細(xì)胞生長的影響。斜生柵藻FSP-3的最適培養(yǎng)條件為1×106cells/mL的接種量,28℃培養(yǎng),6000lx的光照強度和初始pH為6.0-6.5；而斜生柵藻AS-6-1最適合生長的培養(yǎng)條件為：1×106cells/mL的接種量,30℃培養(yǎng),6000lx的光照強度和pH為6.5的初始pH。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,斜生柵藻FSP-3和AS-6-1的生長情況均得到了明顯的改善,不但生物量積累增加,而且多糖、蛋白質(zhì)、總脂等胞內(nèi)組分的含量也顯著地提高。 以游離斜生柵藻FSP-3細(xì)胞為受體,采用電擊法將含有CaMV35S啟動子、報告基因gfp、選擇標(biāo)記基因cat的載體pCAMBIA1302-CAT導(dǎo)入藻細(xì)胞中,并對電擊轉(zhuǎn)化的相關(guān)參數(shù)進行了優(yōu)化,結(jié)果表明在質(zhì)粒濃度為50μg/mL,滲透液濃度為0.2mol/L,脈沖時間為2ms,脈沖電壓為2kV的條件對斜生柵藻FSP-3進行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化效率高達494±48/106受體細(xì)胞,而且轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定傳代10個月,得到的轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性是目前微藻遺傳轉(zhuǎn)化研究中較高水平。進而,利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別定性和定量檢測報告基因gfp在轉(zhuǎn)化子中的表達,證明所選用的載體元件包括啟動子CaMV35S、報告基因gfp、選擇標(biāo)記基因cat在斜生柵藻FSP-3遺傳轉(zhuǎn)化體系中均有效可用。同時采用PCR, Southern blot以及RT-PCR方法對轉(zhuǎn)化子進行了分析,從DNA和RNA水平上證明了載體pCAMBIA1302-CAT成功地導(dǎo)入斜生柵藻FSP-3細(xì)胞中,并將T-Border之間的區(qū)域隨機整合到柵藻FSP-3基因組中。由此建立了斜生柵藻FSP-3高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系,并為外源基因的導(dǎo)入奠定基礎(chǔ)。 將含有酵母絮凝基因FLO1的表達載體pCAMBIA1302-CAT-FLOl導(dǎo)入斜生柵藻FSP-3細(xì)胞中,篩選得到具有絮凝性狀的陽性轉(zhuǎn)化子,并通過熒光顯微鏡和掃描電鏡從細(xì)胞水平上觀察到由于酵母絮凝基因FLO1的導(dǎo)入,引起了藻細(xì)胞絮凝的現(xiàn)象。利用PCR、RT-PCR對轉(zhuǎn)化子進行了分析,證明了酵母絮凝基因FLO1成功導(dǎo)入斜生柵藻FSP-3細(xì)胞中并進行了有效地表達,從而賦予了轉(zhuǎn)化子細(xì)胞絮凝的特性。通過轉(zhuǎn)基因藻株與野生型藻株的生長代謝情況進行研究,發(fā)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入表達對柵藻細(xì)胞生長的并不顯著。由此證明酵母的絮凝基因可在微藻中進行表達,并賦予微藻自絮凝性狀。 通過比較天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1和轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻FSP-3-FLO1,發(fā)現(xiàn)二者絮凝形態(tài)和絮凝性能存在較大差異：轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝顆粒較大,表現(xiàn)出良好的自沉降性能,而天然絮凝微藻AS-6-1對淡水游離藻柵藻FSP-3和小球藻CNW-11具有良好的絮凝沉降能力。另外,天然自絮凝藻AS-6-1絮凝性能具有良好的溫度耐受性和pH穩(wěn)定性,而且不受金屬離子螯合劑EDTA和糖的影響,具體原因與其絮凝活性物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。轉(zhuǎn)基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝性能表現(xiàn)出高溫和pH的敏感性,被EDTA、蛋白酶K解絮以及被甘露糖、半乳糖抑制的現(xiàn)象,其原因歸結(jié)為轉(zhuǎn)基因柵藻FSP-3-FLO1的絮凝性狀是由于表達了外源酵母絮凝蛋白而引起的,絮凝蛋白的穩(wěn)定性和活性直接影響了其細(xì)胞絮凝的性狀。 研究表明天然自絮凝斜生柵藻AS-6-1的絮凝活性物質(zhì)是多糖,其中中性糖、酸性糖和氨基糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為16：9：1,單糖組成中較高的甘露糖含量和較大的分子量等結(jié)構(gòu)特征均與其絮凝活性有關(guān)。該絮凝物質(zhì)對淡水藻柵藻FSP-3和小球藻CMW-11具有良好的絮凝活性,添加濃度0.6mg/L時絮凝效率可達到88%,并具有較好的熱穩(wěn)定性。 本文建立的斜生柵藻的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法為斜生柵藻的分子育種和利用其作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白等高值產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。絮凝微藻的構(gòu)建和天然微藻的絮凝研究,為利用細(xì)胞絮凝采收微藻的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

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5 夏建榮,高坤山;CO_2濃度升高對斜生柵藻生長和光合作用的影響[J];植物生理學(xué)通訊;2002年05期

6 林毅雄,付德賢;漢沽污水庫生物凈化效應(yīng)——DDT、666對斜生柵藻[Scendesmus Obliquus(Turp)KuTZ]生長量、色素含量及吸收光譜的影響[J];環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備;1982年05期

7 秦洪偉;陳柳芳;魯楠;秦偉超;袁星;;氧氟沙星對斜生柵藻的毒性效應(yīng)[J];環(huán)境化學(xué);2011年04期

8 葉清泉;黎尚豪;;光照強度對于斜生柵藻Scenedsmus obliquus(Turp.)K tz.生長的影響[J];水生生物學(xué)報;1956年01期

9 聶湘平,藍崇鈺,林里,黃銘洪;多氯聯(lián)苯對蛋白核小球藻和斜生柵藻生長影響的研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2002年01期

10 季祥;王金榮;丁瀟;蔡祿;;一株斜生柵藻的篩選及生長條件的優(yōu)化[J];水產(chǎn)科技情報;2010年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 秦洪偉;陳柳芳;魯楠;趙亞輝;袁星;;恩諾沙星對斜生柵藻的毒性效應(yīng)研究[A];中國毒理學(xué)會環(huán)境與生態(tài)毒理學(xué)專業(yè)委員會第二屆學(xué)術(shù)研討會暨中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)與基準(zhǔn)專業(yè)委員會2011年學(xué)術(shù)研討會會議論文集[C];2011年

2 趙麗嘉;李慧敏;杜桂森;;銅綠微囊藻對斜生柵藻增殖的影響(英文)[A];Chenia--Contributions to Cryptogamic Biology(Vol.10)[C];2011年

3 章典;李源;周揚;冉穎霞;張庭廷;;香根油對銅綠微囊藻和斜生柵藻生長的影響[A];中國第五屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

4 應(yīng)成琦;陸建學(xué);來琦芳;王慧;周凱;么宗利;;鹽堿脅迫對斜生柵藻生長及光合特性的影響[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

5 曹小歡;黃茁;;斜生柵藻對汞和DBP協(xié)同作用的毒性研究[A];2010中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集(第三卷)[C];2010年

6 張敬鍵;呂雪娟;李愛芬;萬凌琳;吳洪;尹順吉;張成武;;微藻細(xì)胞油脂含量的快速檢測方法研究[A];中國藻類學(xué)會第八次會員代表大會暨第十六次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2011年

7 秦山;劉國祥;胡征宇;;斜生柵藻細(xì)胞中類胡蘿卜素的積累與代謝[A];中國海洋湖沼學(xué)會藻類學(xué)分會第七屆會員大會暨第十四次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2007年

8 葛會林;劉樹深;朱祥偉;;三聚氰胺的微板熒光藻毒性研究[A];第五屆全國環(huán)境化學(xué)大會摘要集[C];2009年

9 王志強;朱琳;;常用抗菌藥對藻類的急性毒性效應(yīng)[A];中國毒理學(xué)會第四屆全國學(xué)術(shù)會議論文（摘要）集[C];2005年

10 劉然;馮流;王珊珊;王潔;;硝基苯類化合物對水生生物毒性的構(gòu)效關(guān)系及其比較[A];第五屆全國環(huán)境化學(xué)大會摘要集[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭鎖蓮;轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細(xì)胞絮凝的研究[D];大連理工大學(xué);2013年

2 鄧平;三種沉水植物對浮游植物的化感效應(yīng)研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2007年

3 劉薇;部分典型有機污染物及其主要降解產(chǎn)物的生態(tài)毒理效應(yīng)研究[D];大連理工大學(xué);2008年

4 吳曉輝;常見眼子菜科沉水植物對浮游藻類的化感作用研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2005年

5 賀立靜;微藻產(chǎn)氫研究及2種綠藻氫酶基因的克隆[D];暨南大學(xué);2007年

6 陳慧;三種典型手性污染物對綠藻和擬南芥的毒性效應(yīng)研究[D];浙江大學(xué);2013年

7 楊從發(fā);木薯酒精廢糟培養(yǎng)小球藻工藝及靈芝生物轉(zhuǎn)化小球藻的研究[D];江南大學(xué);2009年

8 史順玉;溶藻細(xì)菌對藻類的生理生態(tài)效應(yīng)及作用機理研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2006年

9 曾輝;長江和三峽庫區(qū)浮游植物季節(jié)變動及其與營養(yǎng)鹽和水文條件關(guān)系研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2006年

10 朱小山;幾種人工納米材料的生態(tài)毒理學(xué)研究[D];南開大學(xué);2007年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳柳芳;三種喹諾酮類抗生素對斜生柵藻的毒性效應(yīng)[D];東北師范大學(xué);2010年

2 李靜靜;重金屬元素對斜生柵藻（Scenedesmus Obliquus）生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 張婧;溫度波動對斜生柵藻種群動態(tài)和誘發(fā)性群體形成的影響[D];南京師范大學(xué);2013年

4 牛艷紅;三種微藻比較代謝組學(xué)及脂含量提高的研究[D];天津大學(xué);2012年

5 江晶;萘對斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）毒性效應(yīng)研究[D];東北師范大學(xué);2010年

6 陳雷;重金屬脅迫對斜生柵藻和銅綠微囊藻生長及葉綠素?zé)晒馓匦匝芯縖D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 韓松芳;利用城市污水培養(yǎng)高脂肪微藻的光生物反應(yīng)工藝研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2013年

8 胡曉娜;重金屬與異丙甲草胺對斜生柵藻的聯(lián)合毒性及手性選擇性差異研究[D];浙江工商大學(xué);2014年

9 王輝霞;富油斜生柵藻固定CO_2的試驗研究[D];青島理工大學(xué);2010年

10 彭文琴;不同碳源和光照周期對三種微藻生長及油脂積累的影響[D];南昌大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因絮凝斜生柵藻的構(gòu)建和自絮凝斜生柵藻細(xì)胞絮凝的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：127920