【摘要】 近年來,法醫(yī)DNA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的工作量愈來愈大,對(duì)血斑樣品大規(guī)模自動(dòng)化提取的需求亦愈來愈大。此外,一些重大案件法醫(yī)DNA檢驗(yàn)過程常會(huì)碰到各種疑難生物檢材,這些檢材多為少量甚至痕量、還會(huì)受到周圍環(huán)境的影響而導(dǎo)致DNA分子受損或DNA鏈斷裂。但這些檢材往往又是偵查破案的唯一線索,對(duì)疑難生物檢材DNA的提取環(huán)節(jié)變得尤為關(guān)鍵,也成為制約法醫(yī)DNA分析的“瓶頸”。因此,選擇高性能的DNA純化方法成為法醫(yī)DNA建庫和案件分析的首要條件。目前,用于法醫(yī)樣本DNA純化的方法主要有酚-氯仿抽提法、Chelex-100法和磁性分離法。相比酚-氯仿抽提法和Chelex-100去,磁性分離法不僅克服了傳統(tǒng)方法需要離心、操作繁瑣、污染環(huán)境等缺點(diǎn),同時(shí)還可以配套自動(dòng)化儀器,滿足樣品純化高通量的需求。本課題以二氧化硅磁性微粒為載體,以血斑為實(shí)驗(yàn)樣本,通過對(duì)純化過程中的裂解、結(jié)合、清洗、洗脫四個(gè)環(huán)節(jié)的優(yōu)化,確立了血斑樣本DNA純化的方法,并對(duì)純化所得的DNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè),對(duì)批間差、批內(nèi)差以及方法的穩(wěn)定性做了系統(tǒng)評(píng)價(jià)；與同類產(chǎn)品進(jìn)行比較,以PCR-STR分型檢測(cè)對(duì)方法的性能進(jìn)行了的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：用該方法可以從直徑為5 mm2的血斑樣本中得到50-70 ngDNA;方法具有較好的穩(wěn)定性,平均批內(nèi)差為9.23%,批間差為12.36%；與國內(nèi)外產(chǎn)品進(jìn)行比較并進(jìn)行STR復(fù)合熒光擴(kuò)增,表明該方法不僅滿足STR分型檢測(cè)的需要,而且還可跟市售的同類產(chǎn)品相媲美,用本課題建立的方法得到的DNA不含PCR擴(kuò)增抑制劑。將優(yōu)化的體系用于唾液、指甲、煙蒂、頭發(fā)、拭子等多種微量樣本的DNA純化,并以下游PCR-STR分型檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,用該方法得到的DNA用于PCR-STR分型,16個(gè)STR基因座均得到了正確分型結(jié)果。說明方法同樣適用于多種法醫(yī)生物檢材,并且能夠得到較好的分型結(jié)果。 

第一章前言

人類基因組以染色質(zhì)的形式存在于細(xì)胞核內(nèi),在各類案件或事件現(xiàn)場所留下的生物檢材,只要含有一定數(shù)量的有核細(xì)胞或破碎的細(xì)胞核,均可以提到基因組DNA隨著法醫(yī)DNA分析技術(shù)的發(fā)展,DNA在法庭科應(yīng)用也變得越來越重要,相比DNA分析技術(shù)。法醫(yī)DNA檢驗(yàn)常常需要從各種微量甚至痕量的檢材中提取基因組DNA的發(fā)展,法醫(yī)疑難檢材的DNA高效提取是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)成功的重要一前提。針對(duì)這一現(xiàn)狀,國外許多公司已經(jīng)開發(fā)和研制了以磁珠法為載體的法醫(yī)樣本DNA純化試劑盒,并且實(shí)現(xiàn)了DNA純化和分析的自動(dòng)化。國內(nèi)對(duì)這方面的研究較晚,目前我國法醫(yī)DNA建庫試劑80%以上均為國外試劑�；谝陨显�,本課題組提出了以自主開發(fā)研制的磁性微粒為載體建立法醫(yī)樣本的DNA純化方法。本研究的主要工作包括以磁性微粒為載體,建立法醫(yī)樣本DNA純化的方法。對(duì)以磁性微粒為載體的法醫(yī)樣本DNA純化方法進(jìn)行系統(tǒng)全面的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。將建立的法醫(yī)樣本DNA純化方法應(yīng)用于多種法醫(yī)檢材,使建立的方法適用于多種生物檢材。
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第二章基于磁性微粒的法醫(yī)樣本核酸純化方法的建立

2.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器
目前針對(duì)法醫(yī)樣本的DNA純化方法使用最廣泛的是酚一氯仿抽提法, 這些方法存在操作復(fù)雜,過程繁瑣,污染環(huán)境且不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等弊端,與此相比,磁性微粒應(yīng)用于DNA純化克服了以上缺點(diǎn),具有明顯的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用磁性微粒純化法醫(yī)樣本DNA在國外已經(jīng)批量生產(chǎn),許多公司已經(jīng)推出了相應(yīng)的DNA純化試劑盒并使DNA純化邁入了自動(dòng)化的階段。但是,國內(nèi)對(duì)這方面的研究較為落后�；谝陨显�,本文建立以自主開發(fā)研制的二氧化硅磁性微粒為載體建立法醫(yī)樣本的DNA純化方法。以二氧化硅磁性微粒為載體,建立法醫(yī)樣本的DNA純化方法,主要包括樣本的裂解,DNA的結(jié)合, 非特異性吸附的清洗及DNA洗脫這四個(gè)環(huán)節(jié),方法示意圖如圖2-1。

2.2實(shí)驗(yàn)方法
核酸在細(xì)胞中以染色質(zhì)的形式與各種蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在于細(xì)胞核內(nèi),對(duì)于核酸的分離純化主要是將核酸與蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等生物大分子分離開。一般來說,核酸分離純化的方法大多都包括細(xì)胞裂解,酶處理,核酸與生物大分子分離、核酸純化這幾個(gè)主要步驟。其中最主要一步就是對(duì)細(xì)胞的裂解,細(xì)胞只有得到充分的裂解,才能使遺傳物質(zhì)完全的釋放出來,得到更多的DNA,提高純化效果所以選擇合適的裂解液就變得有為的重要。裂解液的作用主要有以下幾個(gè)方面①能夠破壞脂質(zhì)雙分子層,破裂細(xì)胞②能夠使蛋白變性,并能夠抑制蛋白酶活性。對(duì)于裂解條件的確定主要通過正交試驗(yàn)的方法來進(jìn)行,一般來說,影響樣本裂解的因素除了裂解液外,裂解溫度、裂解時(shí)間也是影響裂解效果的重要因素,因此對(duì)于裂解條件的確定主要通過正交試驗(yàn)的方法來進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)確定的因素包括裂解液外、裂解溫度、裂解時(shí)間,分別記作ABC,并且每個(gè)因素均取三個(gè)水平.

第三章磁性微粒用于法醫(yī)樣本核酸純化方法的評(píng)價(jià).........…39
3.1實(shí)驗(yàn)材料和使用儀器…39
第四章法醫(yī)微量檢材的基因組入純化……45
4.1實(shí)驗(yàn)材料和使用儀器……45
4.2實(shí)驗(yàn)部分.........46
全文總結(jié)...........55

第四章法醫(yī)微量檢材的基因組DNA純化

 

4.1實(shí)驗(yàn)材料和使用儀器
對(duì)于法醫(yī)STR檢驗(yàn)來講,主要是通過檢驗(yàn)細(xì)胞核中的人基因組DNA來進(jìn)行個(gè)體識(shí)別或親緣關(guān)系鑒定。通常使用的生物樣本有血液、精液、組織、唾液、毛發(fā)和骨頭等。以建立的磁性微粒為載體的血斑樣本純化方法進(jìn)一步應(yīng)用到口腔拭子、煙蒂、指甲、頭發(fā)等多種法醫(yī)樣本的DNA純化,得到的DNA進(jìn)行STR熒光復(fù)合擴(kuò)增來驗(yàn)證方法的可靠性。

4.2實(shí)驗(yàn)部分
檢材處理注意事項(xiàng)口腔拭子的準(zhǔn)備,清水漱口三遍,用口拭子棉簽在口腔兩側(cè)輕輕地擦拭,陰干,備用。對(duì)于口腔拭子需要注意的是,口腔粘膜細(xì)胞用肉眼是看不見得,所以對(duì)于口腔拭子來說,取材的部位就變得非常的重要,通常剪取含有口腔粘膜細(xì)胞的口腔棉簽外圍薄博的一層,如果將整個(gè)口腔拭子棉簽進(jìn)行裂解,可能會(huì)因?yàn)榭谇幻藓炛械碾s質(zhì)影響純化的效果。對(duì)于煙蒂的純化需要注意的是因?yàn)榭谇徽衬ぜ?xì)胞用肉眼是看不見得,所以對(duì)于煙蒂來說,取材的部位就變得非常的重要。一般來說,對(duì)于有明顯咬痕的煙蒂我們通常剪取位于咬痕部位以上的部分,對(duì)于沒有明顯咬痕的煙蒂,則盡量剪取煙蒂的上端,DNA數(shù)據(jù)庫的建立在法庭案件偵破中的作用越來越重要,隨著DNA庫大規(guī)模的建設(shè),DNA提取,加樣等步驟成為制約DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)的“瓶頸”,為了迎合DNA數(shù)據(jù)庫的快速建設(shè),將本文建立的DNA純化方法進(jìn)一步的調(diào)整使之能自與動(dòng)化核酸提取儀配套使用,使該方法具有更廣泛的應(yīng)用范圍。
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全文總結(jié)

以血斑樣品做為實(shí)驗(yàn)樣本,確立建立的以磁性微粒為載體的法醫(yī)樣本DNA純化的方法,通過對(duì)裂解、結(jié)合、清洗、洗脫這四個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過熒光定量對(duì)該方法純化得到的DNA定量,可從直徑為5mm的血斑樣本中得到50-70ngDNA。通過使用本文建立的方法對(duì)口腔拭子、煙蒂、指甲、頭發(fā)等對(duì)多種法醫(yī)生物檢材進(jìn)行DNA并用得到的DNA進(jìn)行下游STR分型檢測(cè),結(jié)果顯示本文建立的法醫(yī)樣本DNA純化方法可適用于多種生物檢材通過用該方法, 結(jié)果表明,用該方法得到的DNA進(jìn)行STR分型結(jié)果成功率達(dá)到85%,本文建立的以磁性微粒為載體的法醫(yī)樣本DNA純化方法效果更好同時(shí),將該方法稍作調(diào)整也可以和自動(dòng)化的儀器配套使用。

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本文編號(hào)：11771