【摘要】 魚(yú)翅是我國(guó)傳統(tǒng)“海八珍”之一，屬于高值水產(chǎn)加工品，伴隨我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，魚(yú)翅消費(fèi)量逐年增大，魚(yú)翅市場(chǎng)上也因此浮現(xiàn)出諸多亂象。某些商販將明膠等材料或者鰩類魚(yú)翅標(biāo)注為鯊魚(yú)魚(yú)翅進(jìn)行販賣干擾魚(yú)翅貿(mào)易的正常進(jìn)行，而不法分子捕撈瀕危物種進(jìn)行割取魚(yú)翅不僅對(duì)魚(yú)翅貿(mào)易造成了較大阻礙，也人為加重了某些鯊類的瀕危程度。為了規(guī)范魚(yú)翅市場(chǎng)，打擊瀕危物種的貿(mào)易并避免欺騙消費(fèi)者現(xiàn)象的發(fā)生，鑒于此，進(jìn)行魚(yú)翅物種鑒別具有重要意義。傳統(tǒng)的魚(yú)翅鑒別主要通過(guò)感官鑒定法開(kāi)展，感官鑒定法能夠提供一定的魚(yú)翅商品名分類信息，但無(wú)法提供準(zhǔn)確的魚(yú)翅物種來(lái)源信息。鑒于DNA條形碼在水產(chǎn)品物種鑒定中運(yùn)用廣泛，準(zhǔn)確性高等原因，本文基于DNA條形碼方法進(jìn)行魚(yú)翅物種鑒別的相關(guān)研究。魚(yú)翅為鯊魚(yú)魚(yú)鰭中的角質(zhì)鰭條，屬于致密結(jié)締組織，細(xì)胞含量不豐富。本文中研究的魚(yú)翅樣品為市場(chǎng)上最為常見(jiàn)的明翅，即一種半加工形態(tài)魚(yú)翅制品。此類魚(yú)翅是經(jīng)由鯊魚(yú)魚(yú)鰭通過(guò)褪沙（去皮），去除殘肉與軟骨，漂白曬干等加工步驟得到的。上述原因造成了魚(yú)翅DNA提取的困難。為了獲取能夠滿足條形碼鑒定所需的DNA，本文針對(duì)魚(yú)翅特性采用了發(fā)制-凍干的前處理方法進(jìn)行魚(yú)翅組織破碎，選取了Chelex-100螯合樹(shù)脂法，STE法，經(jīng)典CTAB法以及試劑盒純化法用于魚(yú)翅DNA提取效果的比較以選取最佳方法。根據(jù)比較結(jié)果，針對(duì)CTAB提取方法中的進(jìn)行了多個(gè)步驟的優(yōu)化與改進(jìn)，提出了改良CTAB法用于魚(yú)翅DNA提取。根據(jù)DNA濃度值/純度值以及PCR擴(kuò)增成功率，改良CTAB法能夠獲得較好的魚(yú)翅DNA提取效果。為了準(zhǔn)確進(jìn)行國(guó)內(nèi)水產(chǎn)市場(chǎng)中魚(yú)翅制品的物種來(lái)源調(diào)查，本文選取了我國(guó)北方魚(yú)翅貿(mào)易中心城市青島及占全國(guó)魚(yú)翅貿(mào)易總量90%以上的廣東省分別進(jìn)行采樣。本文針對(duì)共計(jì)例107魚(yú)翅樣品進(jìn)行了DNA條形碼鑒別研究。除了選取COⅠ（cytochrome oxidase subunit Ⅰ）外，還著重考慮了使用16SrRNA編碼基因進(jìn)行魚(yú)翅鑒別的可行性與準(zhǔn)確性。針對(duì)魚(yú)翅樣品的物種鑒定結(jié)果顯示：魚(yú)翅的物種來(lái)源較豐富，涵蓋不同鯊類10種，如尖吻鯖鯊，路氏雙髻鯊，鐮狀真鯊，大青鯊等；基于16SrRNA序列的鑒定結(jié)果與基于COⅠ序列的鑒定結(jié)果一致。多數(shù)樣本與已知物種的現(xiàn)有序列之間能夠在聚類關(guān)系中形成單系，其中來(lái)源于灰鯖鯊屬尖吻鯖鯊的魚(yú)翅樣品的存在兩類聚類關(guān)系，基于兩基因的聚類關(guān)系一致。而針對(duì)真鯊屬不同種的鑒定結(jié)果顯示，16SrRNA未能鑒別出來(lái)源于杜氏真鯊與蒂氏真鯊的魚(yú)翅樣本，進(jìn)一步分析顯示，這是由于NCBI中相關(guān)序列（全基因組及16S相關(guān)基因）的缺少所造成的，同時(shí)也表明基于16SrRNA在進(jìn)行真鯊屬不同鯊魚(yú)物種鑒別水平上的準(zhǔn)確性�？梢缘贸鼋Y(jié)論，16SrRNA基因適用于常見(jiàn)魚(yú)翅的物種來(lái)源鑒定。本文針對(duì)鯊魚(yú)物種進(jìn)行分析顯示，存在兩類雙髻鯊類（路氏雙髻鯊與錘頭雙髻鯊）為華盛頓公約附錄Ⅱ中禁止國(guó)際貿(mào)易的物種，所占比例達(dá)到所檢魚(yú)翅的14.01%，上述兩類鯊魚(yú)及其相關(guān)制品屬于我國(guó)二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，其相關(guān)貿(mào)易違反了我國(guó)現(xiàn)有法律條例。此外，所檢魚(yú)翅樣品存在大眼長(zhǎng)尾鯊、尖吻鯖鯊等根據(jù)紅色名單劃分屬于“易危”類別，雖然我國(guó)現(xiàn)目前并沒(méi)有針對(duì)此兩類鯊魚(yú)制定強(qiáng)制性法律要求，但世界范圍的漁業(yè)管理部門已將此兩類鯊魚(yú)作為重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象，應(yīng)當(dāng)控制其及其制品的相關(guān)貿(mào)易。鑒于上述現(xiàn)象，亟需基于物種水平的實(shí)施鯊魚(yú)資源管理特別是魚(yú)翅物種來(lái)源鑒定及管理措施，以保護(hù)瀕危特種鯊魚(yú)并維持鯊類資源可持續(xù)利用。

第 1 章  緒  論

法醫(yī)DNA 檢驗(yàn)技術(shù)的主要對(duì)象是生物物證，即人的細(xì)胞核基因組 DNA。法醫(yī)DNA 檢材一般分為常量檢材、微量檢材、接觸檢材等。 常見(jiàn)的常規(guī)檢材包括人血、唾液和混合斑等。本文中涉及的常量檢材主要指血痕和唾液斑。標(biāo)準(zhǔn)的血斑載體包括FTA 卡、濾紙、紗布（線）、棉簽，部分唾液斑是送檢煙蒂。這些常見(jiàn)的載體中，紗布（線）長(zhǎng)時(shí)間保存DNA 的效果較棉簽差；棉簽不利于DNA 分子的釋放；濾紙長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)使溶液中漂浮紙纖維；煙蒂過(guò)濾嘴部位的煙紙通常是含色素的；標(biāo)準(zhǔn) FTA卡含有特殊成分，能更大限度防止 DNA 降解，但純水浸泡清洗時(shí)不容易去除血色素。因此，對(duì)不同的檢材載體，需要分別研究其最佳提取量；另外，常量檢材在提取、保存、送檢的過(guò)程中可能會(huì)存在不同程度的 DNA 降解、含有各種雜質(zhì)等現(xiàn)象，所以提取過(guò)程中的體系體積、加入的Chelex-100 及蛋白酶 K 的量、消化時(shí)間、變性時(shí)間，甚至浸泡清洗過(guò)程都可能會(huì)對(duì)提取的DNA 模板質(zhì)量產(chǎn)生影響。Chelex-100 提取法的不足之處是原始檢材的所有成分，包括蛋白、肝素、血紅素以及檢材基質(zhì)中所含的染料等各種雜物都在提取后的 DNA 液中，有時(shí)可能會(huì)對(duì)DNA 擴(kuò)增產(chǎn)生影響[8]。長(zhǎng)時(shí)的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血紅素；但同時(shí)清洗檢材時(shí)可能損失部分 DNA，所以應(yīng)平衡清洗抑制劑與損失DNA 之間的關(guān)系。 但是，由于Chelex-100 法有DNA 提取時(shí)間短、提取方法簡(jiǎn)便、成本不高，提取過(guò)程不換管，減少了可能造成檢材污染的環(huán)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，在Chelex-100 法的基礎(chǔ)上還可以對(duì)DNA 提取進(jìn)行各種純化，目前，Chelex-100法已經(jīng)成為法醫(yī)DNA 提取的基本方法。
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第 2 章 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料、儀器和試劑
為最大限度降低其他條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，每個(gè)對(duì)照組所用的檢材及試劑均采用同一來(lái)源的，不同對(duì)照組（即編號(hào)前兩位字母一致的檢材）盡量在同一條件、同一時(shí)間、同一臺(tái)機(jī)器上進(jìn)行提取、定量、擴(kuò)增、電泳。 降解檢材及腐敗檢材因DNA含量不定且含有大量DNA擴(kuò)增干擾物，為提高檢驗(yàn)一次成功率一般采用磁珠法，不在本實(shí)驗(yàn)討論范圍內(nèi)。Chelex-100濃度：分別剪取0.2cm×1.0cm  FTA血卡溶于100μL 5% chelex-100、10% chelex-100、15% chelex-100、20% chelex-100，編為BB組。 蛋白酶K：在0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100體系中，分別加入3μL、5μL、8μL、10μL、20μL蛋白酶K（PK），編為BC組。 56℃消化時(shí)間：對(duì)0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100+10μL PK體系，分別56℃消化30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘，編為BD組。 98℃變性時(shí)間：對(duì)0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μL chelex-100+10μL PK體系，分別98℃變性3分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、20分鐘，編為BE組。

2.2 方法
剪取適量生物檢材，置于0.5ml 離心管內(nèi)，加入適量純水，震蕩 30 秒，室溫浸泡 20 分鐘[33]， 13,000rpm 離心 5 分鐘，，吸棄上清，管底留約 20μl左右液體及檢材基質(zhì)，加入 30—150μl  Chelex-100 及 PK 5-20μl，56℃ 30 至 90 分鐘不等，100℃ 5-20 分鐘，10,000rpm 離心 2 分鐘，上清備用[34]。取適量唾液斑樣品，放入 0.5ml 的離心管中，加入 0.5ml 純水，振蕩混勻30 秒，室溫浸泡30 分鐘；13,000rpm離心3 分鐘，去除上清液，保留載體；加入 100μl 10% Chelex-100 溶液和 5μl PK，56℃保溫 1 小時(shí)，振蕩5-10 秒；98℃變性15 分鐘，振蕩30 秒；13,000rpm 離心2 分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增效果可能受環(huán)境溫度、擴(kuò)增試劑盒存放時(shí)間、擴(kuò)增液混勻程度等因素影響，因此，根據(jù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委（CNAS）關(guān)于 DNA 實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的相關(guān)要求，每次擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)該同時(shí)擴(kuò)增control DNA（9947）以作陽(yáng)性對(duì)照，觀察擴(kuò)增效果；以擴(kuò)增純水作為陰性對(duì)照，觀察有無(wú)體系污染。

第2 章  實(shí)驗(yàn)材料與方法.....................15

2.1 材料、儀器和試劑.....................15

2.2 方法.....................22

第3 章  結(jié)果與討論.....................27

3.1 Qubit2.0 定量結(jié)果.....................27

3.2 電泳結(jié)果.....................44

第4 章  結(jié)論.....................64

第 3 章  結(jié)果與討論

3.1 Qubit2.0 定量結(jié)果
檢材量對(duì)照組：將常量生物檢材按載體材質(zhì)分為組，每小組取5個(gè)樣本盡量保持相同條件進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察平均值。 抗凝血：分成1-5天、6-15天、15天以上共三大組，分別編為AA、AB、AC組，每組混勻后分別用移液器抽取5μL、10μL、15μL、20μL，進(jìn)一步分小組。 血紗：剪取0.3cm長(zhǎng)紗線，每組分別放入1-5根紗線，編為AD組。 棉簽：表層帶血處剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm，編為AE組。 濾紙：血斑中心處剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm單層濾紙，編為AF組。 FTA卡：血斑中心處剪取0.3 cm×0.3 cm、0.3 cm×0.5 cm、0.3 cm×0.8cm、0.3cm×1.0 cm單層濾紙，編為AG組。

3.2 電泳結(jié)果
加入5%濃度Chelex-100的對(duì)照組（BBA1-5）的電泳峰值略低于高濃度（10%、15%、20%）的對(duì)照組，但是相差不大。這說(shuō)明5%濃度的Chelex-100已足夠使用，雖然考慮到Chelex-100本身的特性、適當(dāng)提高濃度以防止大批量提取過(guò)程中不能吸取到Chelex-100顆粒影響提取結(jié)果的情況是必要的，也不需要配置過(guò)高濃度的Chelex-100造成試劑的浪費(fèi)。 在0.2cm×1.0cm FTA血卡+100μl chelex-100體系中，加入5μl以上的蛋白酶K基本上提取DNA的質(zhì)和量就不會(huì)再隨著加入的試劑增加而進(jìn)一步。即在此體系中，蛋白酶的濃度已經(jīng)足夠消化細(xì)胞膜、釋放出DNA分子了，提高PK加入量并不能優(yōu)化電泳結(jié)果。
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第4章 結(jié)論

STR-PCR 已在法醫(yī) DNA 領(lǐng)域開(kāi)展了近 20 年，但國(guó)內(nèi)外法醫(yī) DNA 實(shí)驗(yàn)室的主要科研力量始終未重視常量檢材的提取這一看似普通但應(yīng)用最廣、對(duì)日常檢驗(yàn)工作影響最大的領(lǐng)域。 本研究通過(guò)一系列對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)合 DNA 定量?jī)x讀數(shù)和 ABI 基因分析儀3130xl 電泳結(jié)果，確定了 DNA 實(shí)驗(yàn)室?guī)追N常見(jiàn)載體的常量檢材提取過(guò)程中的最佳提取體積（100μl）、Chelex-100 最低濃度（5%）和 PK 最小加入量（5μl/100μl）、能保證DNA 充分釋放和解鏈的56℃消化時(shí)間（45 分鐘）和98℃變性時(shí)間（8 分鐘）。 同時(shí)，通過(guò)提取同一載體不同量檢材的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，提供了一個(gè)常量檢材法醫(yī)DNA 實(shí)驗(yàn)室各種常見(jiàn)載體的提取檢材量的參考值。
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本文編號(hào)：11749