本文關(guān)鍵詞：斑馬魚抗寒模型的構(gòu)建及魚類相關(guān)基因功能探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）》 2014年

斑馬魚抗寒模型的構(gòu)建及魚類相關(guān)基因功能探討

王倩  

【摘要】：許多魚類都具有非常重要的經(jīng)濟價值，并是我國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。目前環(huán)境變化加劇，氣溫波動大并時常出現(xiàn)嚴寒氣候，帶來魚類越冬死亡率高、越冬成本加大等問題，嚴重制約了魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，建立魚類抗寒機理研究模型，研究闡明魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理具有重要的應(yīng)用意義。本研究對抗寒相關(guān)候選基因進行分析，采用肌肉Ⅲ型肌酸激酶（m3ck）基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚，探討了低溫下可能發(fā)揮作用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；對谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶M（GSTM）基因進行了DNA序列多態(tài)性分析，篩選出與魚類低溫耐受性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記；并對牙鲆IV型抗凍蛋白（AFP-IV）基因進行體外蛋白重組表達，以期對其抗凍活性進行體外分析。主要研究結(jié)果如下： 1、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒并通過顯微注射方法獲得了2個組織特異性轉(zhuǎn)m3ck基因斑馬魚系，Tg(smyd1:m3ck)轉(zhuǎn)基因魚為骨骼肌特異性啟動子smyd1驅(qū)動m3ck表達，Tg(cmlc:m3ck)轉(zhuǎn)基因魚為心肌特異性啟動子cmlc驅(qū)動m3ck表達。將轉(zhuǎn)基因魚培養(yǎng)至F2代，其陽性率分別為34.90%（22/63）和58.75%（47/80）。低溫處理后行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，Tg (smyd1: m3ck)轉(zhuǎn)基因魚游動能力較好、身體偶有擺動、對外界刺激有應(yīng)激性的魚數(shù)目百分比均比野生斑馬魚顯著增加（P 0.05），完全靜止、身體出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)及死亡的魚數(shù)目百分比均比野生斑馬魚顯著減少（P0.05）；Tg(cmlc:m3ck)轉(zhuǎn)基因魚僅表現(xiàn)為身體出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)的魚數(shù)目百分比比野生斑馬魚顯著減少（P0.05）。生理指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，Tg(smyd1:m3ck)轉(zhuǎn)基因魚常溫及低溫下肌肉組織能量（ATP濃度）均比野生斑馬魚顯著增加（P0.05）；Tg (cmlc: m3ck)轉(zhuǎn)基因魚常溫及低溫下心臟組織能量與野生斑馬魚無顯著差異。 2、以Tg (smyd1: m3ck)轉(zhuǎn)基因魚為模型，借助表達譜芯片分析常溫及低溫下轉(zhuǎn)基因魚與野生魚基因表達變化。Microarray檢測到1249個差異轉(zhuǎn)錄本，GO分析及KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的低溫誘導(dǎo)基因主要涉及類固醇生物合成和磷酸肌醇代謝途徑。這些途徑主要參與環(huán)境適應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞膜構(gòu)建等生物過程。野生型斑馬魚的低溫誘導(dǎo)基因涉及MAPK信號通路、NOD受體信號通路、Toll樣受體信號通路、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)換等。此外，轉(zhuǎn)基因魚的低溫抑制途徑主要包括PPAR信號通路、細胞因子受體相互作用等途徑，而野生斑馬魚包括原發(fā)性膽汁酸的生物合成、丙酮酸代謝、醚脂代謝和檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）等與能量代謝密切的生物過程。 3、以Tg (cmlc: m3ck)轉(zhuǎn)基因魚為模型分析能量對心臟的影響。F2代野生斑馬魚幼魚與轉(zhuǎn)基因魚幼魚（48hpf）分別進行低溫（13°C）及常溫（28°C）處理，心臟搏動頻率統(tǒng)計結(jié)果顯示，常溫下野生斑馬魚心率為152.88±4.01次/分，低溫處理后顯著下降為41.20±4.13次/分（P 0.01）；常溫下野生斑馬魚心率為187.50±7.84次/分，低溫處理后為87.82±9.71次/分，均比野生斑馬魚顯著增加（P 0.05）。且低溫下轉(zhuǎn)基因斑馬魚心率可達野生斑馬魚的57.44%。對早期心臟發(fā)育模式進行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因斑馬魚心臟發(fā)育時期比野生斑馬魚有明顯提前。 4、運用PCR-SSCP技術(shù)對斑馬魚實驗群體中低溫耐受及低溫敏感組進行GSTM基因多態(tài)性分析，在第1內(nèi)含子中獲得1個與低溫耐受性狀相關(guān)的多態(tài)位點，，檢測到DD、DE和EE3種基因型，共D、E2個等位基因，該群體的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.408和0.477，多態(tài)信息含量為0.362，在該位點符合Hardy-Weinberg平衡。連鎖分析結(jié)果顯示，這3種基因型與低溫耐受性狀顯著相關(guān)（χ2=8.498，P 0.05）：DD基因型在耐低溫群體中占優(yōu)勢（50.00%），并表現(xiàn)為對受低溫脅迫斑馬魚的保護性因素（OR=0.520,95%CI=0.255-1.061），而DE基因型在不耐低溫群體中占優(yōu)勢（51.31%），表現(xiàn)為低溫脅迫下斑馬魚的危險因素（OR=3.012，95%CI=1.413-6.419）。研究結(jié)果為魚類耐低溫標(biāo)記的篩選提供依據(jù)。 5、在牙鲆cDNA文庫中篩得IV型抗凍蛋白（AFP-IV）同源基因AFP-IV-1、AFP-IV-2。AFP-IV-1基因cDNA全長為652bp，其開放閱讀框為375bp，編碼124個氨基酸殘基；AFP-IV-2基因cDNA全長為781bp，其開放閱讀框為465bp，編碼154個氨基酸殘基。應(yīng)用原核表達系統(tǒng)進行體外重組表達，AFP-IV-1重組蛋白得到成功表達，融合蛋白的分子量理論值為19.36kDa KDa，主要以可溶形式存在，少量以包涵體形式出現(xiàn)。當(dāng)誘導(dǎo)4h、IPTG濃度為0.6mM時，重組蛋白表達量最大。對目的蛋白進行純化，以期對其抗凍活性進行體外分析。 綜合上述結(jié)果，本研究對斑馬魚、牙鲆抗寒相關(guān)候選基因進行分析，揭示大量抗寒相關(guān)候選基因及低溫下可能發(fā)揮作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；篩選出1個與斑馬魚低溫耐受性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記；并純化出可能具有抗凍活性的重組牙鲆抗凍蛋白。研究結(jié)果不僅有助于解析魚類耐抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理，也可為魚類耐低溫標(biāo)記的篩選及其在海水經(jīng)濟魚類抗寒育種中的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：S917.4
【目錄】：

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鮑清;張樂;廖雪;;斑馬魚胚胎篩選致畸藥物之方法探索[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

2 張樂;鮑清;廖雪;;斑馬魚胚胎致畸藥物篩選試驗[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

3 許海;楊明;吳明紅;;雙酚A和壬基酚對斑馬魚胚胎毒性研究[A];第六屆全國環(huán)境化學(xué)大會暨環(huán)境科學(xué)儀器與分析儀器展覽會摘要集[C];2011年

4 于永利;楊景峰;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥福美雙對斑馬魚胚胎體節(jié)以及脊索的影響[A];持久性有機污染物論壇2010暨第五屆持久性有機污染物全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

5 張利軍;史慧勤;彭雙清;;基于斑馬魚模式動物的阿霉素心臟毒性作用研究[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

6 史慧勤;張利軍;彭雙清;;應(yīng)用模式動物斑馬魚觀察異煙肼的一般毒性作用[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

7 閆峻;胡傳祿;張華山;楊紅蓮;田蕾;林本成;林治卿;襲著革;;納米二氧化鈦與雙酚A復(fù)合污染物對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究[A];中國毒理學(xué)會環(huán)境與生態(tài)毒理學(xué)專業(yè)委員會第二屆學(xué)術(shù)研討會暨中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會環(huán)境標(biāo)準與基準專業(yè)委員會2011年學(xué)術(shù)研討會會議論文集[C];2011年

8 巴雅斯胡;楊景峰;于永利;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥代森鋅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎脊索變形[A];持久性有機污染物論壇2011暨第六屆持久性有機污染物全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

9 劉春生;周炳升;張效偉;李廣宇;;內(nèi)分泌干擾物丙基硫氧嘧啶對斑馬魚胚胎的旁觀者效應(yīng)[A];第六屆全國環(huán)境化學(xué)大會暨環(huán)境科學(xué)儀器與分析儀器展覽會摘要集[C];2011年

10 徐挺;張洪昌;趙靜;郭雪萍;尹大強;;五氯酚對斑馬魚胚胎早期發(fā)育基因表達譜影響的研究[A];第六屆全國環(huán)境化學(xué)大會暨環(huán)境科學(xué)儀器與分析儀器展覽會摘要集[C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 許琦敏;[N];文匯報;2011年

2 本報記者 滕繼濮;[N];科技日報;2010年

3 劉霞;[N];科技日報;2010年

4 張?zhí)锟?[N];大眾科技報;2010年

5 孫國根;[N];中國醫(yī)藥報;2009年

6 孫國根　記者 王春;[N];科技日報;2009年

7 羅剛 李兵;[N];健康報;2004年

8 記者 毛黎;[N];科技日報;2008年

9 張忠霞;[N];大眾科技報;2008年

10 記者 馮衛(wèi)東;[N];科技日報;2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金美青;典型手性農(nóng)藥擬除蟲菊酯及其代謝產(chǎn)物對斑馬魚的發(fā)育毒性研究[D];浙江大學(xué);2010年

2 高珊;胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2參與斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育的實驗研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 劉少穎;三唑酮對斑馬魚的胚胎發(fā)育和內(nèi)分泌—生殖毒性[D];浙江大學(xué);2011年

4 常菊花;丁草胺對斑馬魚的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 竺林;激活誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶基因在斑馬魚中的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 王倩;斑馬魚抗寒模型的構(gòu)建及魚類相關(guān)基因功能探討[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2014年

7 張利軍;斑馬魚心臟毒性評價模型的建立及美托洛爾心臟毒性作用機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

8 宋揚;以斑馬魚為模型研究神經(jīng)靶酯酶的功能及其在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生中的作用機制[D];山東大學(xué);2012年

9 陳迪;AGGF1在斑馬魚胚胎血管發(fā)育中的關(guān)鍵作用及機制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

10 朱智慧;核仁因子Def在斑馬魚肝臟部分切除后傷口無疤修復(fù)中的功能研究[D];浙江大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王稼農(nóng);用于藥物安全性評價的斑馬魚生物技術(shù)平臺建設(shè)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

2 丁麗麗;力達霉素抑制斑馬魚胚胎血管生成的實驗研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2010年

3 周瑞芳;凝血因子Ⅲb在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

4 向霄;環(huán)境雌激素與抗雌激素對斑馬魚胚胎的復(fù)合效應(yīng)研究[D];上海交通大學(xué);2012年

5 蒲韻竹;斑馬魚阿爾茨海默病動物模型的建立[D];西南大學(xué);2013年

6 梁榮朝;丙烯酰胺對斑馬魚生物余能的影響及對其肝、鰓毒性的作用[D];哈爾濱商業(yè)大學(xué);2013年

7 邵潘柱;三-（2,3-二溴丙基）異氰脲酸酯對斑馬魚雄性生殖和胚胎的毒性研究[D];東華大學(xué);2014年

8 逯娟;莠去津?qū)Π唏R魚生殖發(fā)育影響的研究[D];河北大學(xué);2009年

9 譚敏卿;菲和高氯酸鈉對斑馬魚的毒性效應(yīng)[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

10 秦帥;活體高通量篩選抑制斑馬魚巨噬細胞遷移的中藥[D];貴陽中醫(yī)學(xué)院;2011年

  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚抗寒模型的構(gòu)建及魚類相關(guān)基因功能探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：117379