【摘要】：理想的骨植入體應具有適度的免疫調(diào)節(jié)和誘導骨形成的能力。鈦種植體雖已廣泛用于硬組織植入領域,但其表面缺乏一定的生物活性,并會引起植入體周圍組織的炎癥響應。基于噬菌體展示技術得到的材料特異性結合噬菌體不僅可以在材料表面形成穩(wěn)定的生物基質,調(diào)控粘附細胞/組織的生物功能,也可結合化學修飾的手段為細胞生長提供多肽、藥物分子等生化信號。轉化生長因子β1(TGF-β1)在炎癥反應及組織的創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要作用。適當改善TGF-β1對炎性及組織細胞的調(diào)控,可促進骨組織的愈合,并減少植入體周圍纖維化的發(fā)生。本研究從M13噬菌體隨機展示肽庫中淘選得到可與酸堿處理的鈦表面特異性結合的鈦結合肽-噬菌體(TBP-phages),并利用該噬菌體對鈦表面進行生物改性。為賦予鈦表面更多的生物功能性,3種TGF-β1親和肽化學結合到噬菌體膜表面。通過與間充質干細胞(MSCs)、巨噬細胞的體外培養(yǎng)及動物體內(nèi)骨植入實驗,綜合評價鈦種植體表面不同噬菌體膜對炎性響應及骨整合的調(diào)控能力,優(yōu)選具有骨免疫調(diào)節(jié)功能的噬菌體修飾的鈦種植體。首先,淘選得到可與酸堿處理的鈦表面(AA)特異性結合的鈦結合肽-噬菌體,經(jīng)DNA測序獲得結合肽TBPs的序列。通過探究噬菌體TBP54-phage與AA表面的結合機制,發(fā)現(xiàn)TBP54-phage主要通過TBP54序列中的FAETHR片段與鈦表面羥基,特別是堿性羥基基團,通過配位及靜電作用結合。這種作用受鈦表面物理結構及化學基團的共同調(diào)控,延長堿處理時間,可提高噬菌體對鈦表面的親和性。將TBP54-phage懸液均勻涂覆于鈦表面,得到納米纖維多孔的噬菌體膜。該噬菌體膜具有良好的穩(wěn)定性和基底選擇性。噬菌體懸液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),可以提高噬菌體膜(APP)的組織均一性。由噬菌體和殼聚糖形成的復合膜,相比單純的殼聚糖膜,具有更好的親水性、耐降解性和膜/基結合性。其次,比較了預處理鈦表面、酸堿處理鈦表面、鈦表面噬菌體膜(APP)及戊二醛交聯(lián)的噬菌體膜(APPG)在成骨分化、體外礦化及巨噬細胞炎性響應方面的性能。鈦表面經(jīng)酸堿處理后,成骨細胞粘附、分化和體外礦化得到改善,巨噬細胞的炎癥響應也有所降低。與之相比,噬菌體膜更為顯著地提高了鈦表面的促成骨分化和體外礦化能力,并在巨噬細胞培養(yǎng)晚期顯示更明顯的炎癥衰退。噬菌體膜經(jīng)戊二醛交聯(lián)后,生物學性能有所下將。接著,利用噬菌體展示技術淘選獲得TGF-β1親和肽(Tβms)�？疾霻βms與TGF-β1間的親和性發(fā)現(xiàn),Tβm16具有相對較高的TGF-β1親和性和較低的TGF-β1免疫反應活性封閉性,Tβm4則相反。Tβms單獨作用可促進成骨細胞的早期增殖,但對細胞堿性磷酸酶(ALP)活性沒有影響。與TGF-β1共同作用時,可增強成骨細胞的骨鈣素表達、ALP活性和Ca沉積。這與Tβms調(diào)控的TGF-β1通路蛋白Smad2/3的磷酸化水平降低有關。為進一步考察Tβms對間充質干細胞(MSCs)成骨分化及巨噬細胞炎性響應的調(diào)控,將TGF-β1親和肽Tβm4、Tβm14和Tβm16接枝于APP表面(TGF-β1親和肽-噬菌體膜)。當噬菌體膜表面預先結合TGF-β1時,接枝Tβm14的噬菌體膜可顯著促進MSCs的成骨分化及礦化,TGF-β1主要促進MSCs的早期成骨分化。在膜表面不含TGF-β1時,APP更有利于MSCs的礦化。將TGF-β1親和肽-噬菌體膜與巨噬細胞共培養(yǎng),TGF-β1親和肽影響表面蛋白吸附、細胞整合素作用及早期炎性表達。巨噬細胞歷經(jīng)凋亡/炎性增強、炎性持續(xù)及表型轉變后,進入炎性衰退階段。表征不同階段巨噬細胞的極化表型表明,噬菌體膜上調(diào)巨噬細胞的早期炎性表達,與TGF-β1親和肽有關,并受TGF-β1促炎通路及NF-κB通路調(diào)控。隨著TGF-β1/Smad抗炎通路的表達,巨噬細胞由促炎向抗炎表型轉變。噬菌體膜中,Tβm4接枝表面炎性響應持續(xù)相對較長。最后,考察了不同噬菌體膜修飾的鈦種植體在大鼠體內(nèi)的前期炎性響應及后期骨整合性。相對酸堿處理的鈦種植體,噬菌體膜顯著提高了鈦種植體表面的骨整合性,且APP在誘導骨形成方面具有最好的效果。在前7天的炎性響應中,Tβm4接枝的種植體表面巨噬細胞浸潤較多,而Tβm16接枝表面有較多的多核巨噬細胞分布。由于受到前期炎性響應的影響,Tβm4接枝表面在2周時觀察到纖維膜的形成,使得之后骨整合受到阻礙;而Tβm16接枝表面由于巨噬細胞的基質降解作用,前4周骨組織重塑較慢。三種TGF-β1親和肽-噬菌體膜中,Tβm14接枝表面具有更好的骨整合性。綜合而言,由鈦結合肽-噬菌體與PVP制備的噬菌體膜具有較好的骨免疫調(diào)節(jié)性能。噬菌體膜接枝TGF-β1親和肽雖然可調(diào)控成骨分化和炎性響應,但在正常骨愈合環(huán)境中沒有體現(xiàn)出優(yōu)勢。
【學位授予單位】：西南交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TG174.4;R318.08
【圖文】：

生物材料引起的巨噬細胞表型及功能的變化對骨愈合的影響

頁 西南交通大學博士研究生學位論文性大分子復合物的前體形式沉積在細胞外基質中，且在被分泌前需要經(jīng)工過程[186]，如圖 1-2 所示。TGF-β1 最初被合成為一個含 390 個氨基酸殘re-pro-TGF-β1），包含 N 端的信號肽 SP，潛活性相關蛋白（LAP）及成熟多數(shù)細胞都會以 LLC 形式（LTBP-LAP-TGF-β）分泌 TGF-β，但成骨細可有效分泌SLC（LAP-TGF-β），且SLC形式更易激活。SLC及LLC形式中其受體結合，不具有生物活性。TGF-β1 的活化需要脫離 LAP 釋放出來變化暴露出來，使其可以與相應受體結合。

TGF-β1信號通路

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相關期刊論文 前2條

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相關博士學位論文 前4條

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相關碩士學位論文 前3條

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本文編號：2768002