本文關(guān)鍵詞：基于TUDCA生物轉(zhuǎn)化的固定化酶填充床反應(yīng)器流場(chǎng)模擬及實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目前�；切苋パ跄懰�(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)主要利用人工提取熊膽汁的方式來(lái)獲得,但由于熊膽資源的稀缺性和來(lái)源的特殊性使TUDCA的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床用藥需求。本文在本課題組提出的雙酶偶聯(lián)固定化酶促反應(yīng)生產(chǎn)TUDCA方法的基礎(chǔ)上,著眼于高效固定化酶生物反應(yīng)器的開發(fā),應(yīng)用FLUENT軟件模擬分析了填充床反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng),探討了流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)反應(yīng)器流場(chǎng)分布的影響,并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)模擬的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和分析,獲得了能在一定程度上代替實(shí)驗(yàn)過(guò)程的CFD模型。研究將為進(jìn)一步反應(yīng)器的設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題來(lái)源于項(xiàng)目編號(hào)為2014ZX09301306-007的國(guó)家科技重大專項(xiàng)新藥創(chuàng)制項(xiàng)目,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)應(yīng)用pGEX-6p-1和GST融合基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)進(jìn)行了表達(dá)和純化,并以殼聚糖為載體對(duì)7α-HSDH和7β-HSDH進(jìn)行了固定。1)通過(guò)GST一步親和純化獲得了7α-HSDH和7β-HSDH游離酶,電泳分析為具有唯一清晰且較寬的條帶,酶的濃度分別為1.776mg/mL和2.059mg/m L,酶比活分別為24.16U/mg和49.36U/mg。2)應(yīng)用戊二醛活化的殼聚糖微球?qū)?α-HSDH和7β-HSDH進(jìn)行固定化,結(jié)果表明兩種酶的固定率均大于98%。(2)利用雙酶偶聯(lián)共固定對(duì)TUDCA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,優(yōu)化獲得了該雙酶偶聯(lián)共固定系統(tǒng)的適宜pH值、溫度和底物濃度,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究確定了酶促反應(yīng)的最佳參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)pH值在7到11范圍內(nèi)變化,固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率為pH9Ph11Ph10pH8pH7,因此最適p H值為9。2)當(dāng)溫度從5℃到60℃變化時(shí),固定化酶催化效率先緩慢升高,然后急劇降低,固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率為25℃15℃5℃37℃45℃60℃,因此最適溫度為25℃。3)當(dāng)?shù)孜餄舛葟?mM到25mM變化時(shí),固定化酶催化能力先增強(qiáng),后減弱,固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率為10mM15mM20mM25Mm5Mm,因此最適底物濃度為10mM。(3)應(yīng)用FLUENT 6.3軟件對(duì)填充床反應(yīng)器的流場(chǎng)進(jìn)行了模擬分析,研究了循環(huán)流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)流場(chǎng)的影響。我們發(fā)現(xiàn):1)當(dāng)反應(yīng)器高徑比一定時(shí),流場(chǎng)的均勻性隨著流速的增大而增大,這將使底物與酶的接觸越充分,越有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。2)在一定流速下,改變高徑比,高徑比越大,液體流過(guò)的相對(duì)橫截面積相同,但是液體在反應(yīng)器中的滯留時(shí)間越長(zhǎng),致使底物與酶接觸時(shí)間越長(zhǎng),越有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。(4)采用固定化酶填充床反應(yīng)器研究驗(yàn)證了循環(huán)流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)TUDCA生物轉(zhuǎn)化的影響。1)在高徑比為30:16,循環(huán)流速分別為1mL/min,2m L/min,4mL/min的反應(yīng)器中,通過(guò)比較體積生產(chǎn)效率,結(jié)果表現(xiàn)為4mL/min2m L/min1m L/min,與模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。2)在流速為2mL/min,高徑比分別為30:16,60:16,100:16的反應(yīng)器中,通過(guò)比較平均單次循環(huán)生成TUDCA的量,結(jié)果表現(xiàn)為100:1660:1630:16,與模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,表明本課題建立的CFD模型可以用于填充床反應(yīng)器固液兩相流動(dòng)過(guò)程的數(shù)值模擬研究,在一定程度上能夠代替實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：填充床反應(yīng)器 流場(chǎng)模擬 固定化酶 HSDH TUDCA
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ052;Q814
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 緒論10-23
• 1.1 �；切苋パ跄懰釃�(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀10
• 1.2 牛磺熊去氧膽酸制備方法及研究現(xiàn)狀10-12
• 1.2.1 化學(xué)合成法11-12
• 1.2.2 生物催化法12
• 1.3 生物酶反應(yīng)器簡(jiǎn)介12-16
• 1.3.1 連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器(CSTR)13-14
• 1.3.2 填充床式反應(yīng)器(PBR)14-15
• 1.3.3 流化床式反應(yīng)器(FBR)15-16
• 1.4 固定化酶技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-19
• 1.4.1 固定化酶載體材料16-17
• 1.4.2 酶固定化方法17-19
• 1.5 計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)概述19-22
• 1.5.1 FLUENT軟件介紹20-22
• 1.6 課題思路及意義22-23
• 2 7α-HSDH和 7β-HSDH表達(dá)與固定23-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 材料與藥品23-24
• 2.1.2 設(shè)備與儀器24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.2.1 7α-HSDH和 7β-HSDH的表達(dá)與純化25-27
• 2.2.2 固定化酶載體的制備及酶的固定27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 2.3.1 7α-HSDH和 7β-HSDH的SDS-PAGE凝膠電泳圖28-29
• 2.3.2 BCA法檢測(cè) 7α-HSDH和 7β-HSDH濃度29
• 2.3.3 7α-HSDH和 7β-HSDH游離酶活性檢測(cè)結(jié)果29-31
• 2.3.4 酶的固定率檢測(cè)結(jié)果31-32
• 2.4 小結(jié)32-33
• 3 固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化33-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 3.1.1 材料與藥品33
• 3.1.2 設(shè)備與儀器33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 3.2.1 pH對(duì)固定化酶底物轉(zhuǎn)化的影響34
• 3.2.2 溫度對(duì)固定化酶底物轉(zhuǎn)化的影響34
• 3.2.3 底物濃度對(duì)固定化酶底物轉(zhuǎn)化的影響34-35
• 3.2.4 固定化酶 4℃貯存條件下的酶活回收率35
• 3.2.5 高效液相色譜分析35-36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析36-40
• 3.3.1 TUDCA、T7KLCA、TCDCA的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線36-38
• 3.3.2 pH對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率的影響38
• 3.3.3 溫度對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率的影響38-39
• 3.3.4 底物濃度對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率的影響39
• 3.3.5 固定化酶 4℃貯存條件下的酶活力回收率39-40
• 3.4 小結(jié)40-41
• 4 FLUENT模擬分析41-52
• 4.1 利用Gambit建立固定化酶反應(yīng)容器的計(jì)算模型41-43
• 4.1.1 Gambit繪制反應(yīng)容器簡(jiǎn)圖41
• 4.1.2 網(wǎng)格的劃分41-42
• 4.1.3 設(shè)置邊界類型及輸出Mesh文件42-43
• 4.2 利用FLUENT設(shè)置計(jì)算參數(shù)43-44
• 4.3 Tecplot處理計(jì)算結(jié)果顯示44-51
• 4.3.1 循環(huán)流速對(duì)流場(chǎng)的影響44-48
• 4.3.2 高徑比對(duì)流場(chǎng)的影響48-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 5 固定化酶反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證52-58
• 5.1 固定化酶反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的搭載52
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 5.2.1 材料與藥品52-53
• 5.2.2 設(shè)備與儀器53
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 5.3.1 循環(huán)流速對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響53-54
• 5.3.2 反應(yīng)容器徑高比對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響54
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析54-56
• 5.4.1 循環(huán)流速對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響54-56
• 5.4.2 高徑比對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響56
• 5.5 小結(jié)56-58
• 6 總結(jié)58-60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 附錄65-67
• 附錄A (3.3.2)65-66
• 附錄B (3.3.3)66-67
• 附錄C (3.3.4)67

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳麗俐;基于TUDCA生物轉(zhuǎn)化的固定化酶填充床反應(yīng)器流場(chǎng)模擬及實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：643082