發(fā)布時間：2020-05-16 14:14

【摘要】：2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)和葡萄糖酸(GA)作為化學(xué)中間體被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、建筑等領(lǐng)域。目前用來生產(chǎn)2KGA和GA的方法主要是微生物發(fā)酵法,但發(fā)酵法存在副產(chǎn)物較多,底物和產(chǎn)物抑制等問題。本研究利用基因同源過表達(dá)技術(shù),分別對本實驗室前期篩選得到的菌株G.oxydans DSM 2003和G.oxydans#1進(jìn)行改造,構(gòu)建并篩選了生產(chǎn)2KGA及GA的高產(chǎn)過表達(dá)菌株,分別優(yōu)化了重組菌株催化合成2KGA和GA的條件,建立了利用靜息細(xì)胞催化法高效生產(chǎn)2KGA的新工藝�，F(xiàn)在分別從合成2KGA和GA兩個方面將主要研究成果總結(jié)如下:第一部分,關(guān)于催化合成2KGA的主要成果及結(jié)論1.成功構(gòu)建并篩選了一株生產(chǎn)2KGA的高產(chǎn)菌株(1)以G.oxydansDSM2003為原始菌株,利用基因同源過表達(dá)技術(shù),成功構(gòu)建并篩選了一株生產(chǎn)2KGA的高產(chǎn)菌株Goxydans_tufB_ga2dh。該重組菌株催化效率比對照菌株提高了97%。(2)在重組菌株中,葡萄糖酸-2-脫氫酶三個亞基的基因goox1230,gox123 和gox1232的轉(zhuǎn)錄水平分別是對照菌株中相對應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的162倍,44倍和59倍,這說明ga2dh基因在重組菌株中成功過量表達(dá)。(3)在7L發(fā)酵罐中,細(xì)胞濃度30g/L,GA濃度為320g/L,重組菌株生產(chǎn)2KGA的時空產(chǎn)率比原始菌提高了約111%。2.優(yōu)化了重組菌株靜息細(xì)胞催化GA生產(chǎn)2KGA的條件(1)在通空氣的條件下,比較合適的催化條件是:細(xì)胞濃度30 g/L,GA濃度為320 g/L,pH5.8,溫度30℃。相應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率約為100%,時空產(chǎn)率為12.76g/L/h,產(chǎn)物2KGA濃度為218 g/L,產(chǎn)率99%。底物濃度高于320 g/L時,反應(yīng)速度隨濃度增加而降低,高濃度底物對細(xì)胞催化活性產(chǎn)生顯著的抑制。(2)溶氧是影響GA轉(zhuǎn)化為2KGA的重要因素。溶氧不足會顯著制約催化反應(yīng)速度。但過高的溶氧條件會導(dǎo)致反應(yīng)體系中靜息細(xì)胞催化活性的喪失。(3)在通入氧氣的條件下,60 g/L靜息細(xì)胞可在45h內(nèi)將480 g/L的GA完全轉(zhuǎn)化為2KGA,產(chǎn)物濃度達(dá)到453 g/L,產(chǎn)率95.3%,時空產(chǎn)率達(dá)到10.07 g/L/h。與文獻(xiàn)已報道的結(jié)果相比,本研究獲得的產(chǎn)量處于領(lǐng)先水平。(4)初步建立了反應(yīng)所得產(chǎn)物的初步純化流程,得到無色透明晶體,經(jīng)檢驗,晶體為2KGA(鈉鹽),純度為98.9%。3、優(yōu)化了重組菌株靜息細(xì)胞催化葡萄糖生產(chǎn)2KGA的條件(1)在通入空氣的條件下,當(dāng)細(xì)胞濃度為60 g/L,葡萄糖濃度為200 g/L時,重組菌株用21h可將全部底物催化生成2KGA,時空產(chǎn)率最高為11.2g/L/h,2KGA濃度為234.6 g/L,產(chǎn)率98%。時空產(chǎn)率比原始菌株提高了 365%。(2)研究了補(bǔ)料分批和連續(xù)流加對催化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明,補(bǔ)料分批的方式對催化效率提升比較明顯。當(dāng)細(xì)胞濃度為60 g/L時,在250 g/L和300 g/L的底物條件下,可分別提升催化效率15%和24%。(3)在通入氧氣的條件下,30 g/L靜息細(xì)胞可在21h內(nèi)將270 g/L的葡萄糖完全轉(zhuǎn)化為2KGA,產(chǎn)物濃度達(dá)到316g/L,產(chǎn)率97%,時空產(chǎn)率達(dá)到15.0 g/L/h。與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比,本研究所獲得的2KGA的產(chǎn)量與時空產(chǎn)率達(dá)到了領(lǐng)先水平。第二部分,關(guān)于合成GA的主要成果及結(jié)論1.成功構(gòu)建并篩選了生產(chǎn)GA的高產(chǎn)菌株。以本實驗室前期篩選得到的菌株G.oxydans#1為原始菌株,利用基因同源過表達(dá)技術(shù),成功構(gòu)建并篩選了高產(chǎn)GA的菌株G.oxydans#1_PtufB_g dh,該重組菌株的催化效率比原始菌株提高了14%。2.研究了葡萄糖濃度對重組菌株催化葡萄糖生成GA的影響。在通入空氣并且細(xì)胞濃度40 g/L的條件下,確定了適宜的底物葡萄糖濃度為250 g/L至300 g/L。在優(yōu)化條件下,重組菌株可在20h將所有葡萄糖消耗完畢,生成的GA濃度為313 g/L,2KGA濃度為38 g/L。GA的時空產(chǎn)率為15.65 g/L/h,GA的產(chǎn)率為89%。時空產(chǎn)率比原始菌株提高了 115%。3.使用補(bǔ)料分批的方法,40 g/L重組菌株靜息細(xì)胞可以在32h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化400 g/L的葡萄糖,生成371 g/L GA和40 g/L 2KGA,GA的時空產(chǎn)率為11.6 g/L/h,選擇率為93%。
【圖文】：

圖１．１邋Ｇ．邋ｏｘｊＹ／ｆｌ／ｗ在電子顯微鏡下的形態(tài)逡逑ｉｇ．邋１．１邋Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ邋ｏｘｙｄａｎｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏ件逡逑Ｇ．ｏｘ；＾ａｍ特別適合在含糖豐富的水果和花卉環(huán)境中

根據(jù)生物學(xué)分類，醋酸桿菌科科由三個屬組成，，它們分別是逡逑也如■及（７／ｗｃｃｗｆｌｃｅｆｏ／＾ｔｏ＊邋（葡萄糖酸醋酸桿菌屬）［９＿１２］。0．ｏｘｊｄｍｓ１逡逑歸屬于葡萄糖桿菌屬（Ｇ／ｗｃｏｍ）６ｆｌｃｔｏ０邋（圖１．２）0逡逑Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ逡逑Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ邋＾邋Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ邐Ｇ．邋ａｌｂｉｄｕｓ逡逑Ｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｇ．邋ｃｅｒｉｎｕｓ逡逑Ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ邋＂ｎ邋＿邐．逡逑Ｇ．邋ｏｘｙｄａｎｓ逡逑Ｉｎｄｕｓ邋ｔｒｉｕｓ逡逑Ｇ．邋ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ逡逑＿邐＾邋Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ逡逑Ｇ．邋ｆｒａｔｅｕｒｉｉ逡逑Ｆａｍｉｌｙ邐Ｇｅｎｅｒａ邐Ｓｐｅｃｉｅｓ邐Ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ逡逑圖１．２邋Ｇ１．邐生物學(xué)分類圖逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｏｘｙｄａｎｓ逡逑按照１６ｓｒＲＮＡ測序結(jié)果分析，葡萄糖桿菌屬由５個種組成，除了Ｇ．邋ｗｑｙＡ／ｒａ種外，還逡逑有其它４個種，它們分別是Ｇ．邐Ｇ．邐Ｇ戶Ｙ／／ｅｗｒ／／，和（７．邐Ｍ邋（圖邋１．２）。逡逑Ｇ邐種可進(jìn)一步分為四個亞種［１４］，如圖１．２所示。逡逑Ｇ／ｗｃｃｗｏＺ？ａｃｒｅｒ?qū)倥cｄｃｅｆｏｈｃ／ｅｒ?qū)倬o密相關(guān)，并被歸類為醋酸菌（ａｃｅｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂａｃｔｅｒｉａ）逡逑Ｈ。Ｇ／ｗｃｃ聊？屬與Ｊｃｅ／ｏ６（７ｃ／ｗ屬有兩個顯著的區(qū)別：一是Ｇ／ｗｏ胤屬具有不逡逑完全的三羧酸循環(huán)（ＴＣＡ）酶，特別是缺乏琥珀酸脫氫酶，阻止了代謝途徑的完整運作，逡逑而具有完整的、在末端氧化起作用的三竣酸循環(huán)（ＴＣＡ）酶。結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ033

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮曉燕;2-酮基-D-葡萄糖酸補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其動力學(xué)研究[D];河北師范大學(xué);2011年

本文編號：2666856