發(fā)布時(shí)間：2017-10-09 00:05

  本文關(guān)鍵詞：核酸探針與環(huán)糊精聚合物用于生物分子熒光檢測(cè)的研究

  更多相關(guān)文章： 核酸探針 信號(hào)放大 DNA β-環(huán)糊精聚合物 腺苷

【摘要】：準(zhǔn)確和靈敏地獲取生物樣品中小分子、核酸的相關(guān)信息對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究以及臨床診斷和治療都具有十分重要的意義。近年來(lái),功能化熒光核酸探針在生物分析領(lǐng)域受到廣大研究者的廣泛關(guān)注,人們利用核酸探針技術(shù)發(fā)展了一系列新穎的檢測(cè)方法,來(lái)獲取生命過(guò)程中的各種信息。環(huán)糊精聚合物具有包絡(luò)識(shí)別能力、穩(wěn)定性強(qiáng)、溶解度大及多價(jià)結(jié)合效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘有顯著的熒光增強(qiáng)作用,可與其它檢測(cè)方法相結(jié)合,發(fā)展更加靈敏的分析檢測(cè)方法�；诖�,本文利用核酸探針技術(shù),并結(jié)合工具酶和β-環(huán)糊精聚合物,建立了三種檢測(cè)生物分子的熒光方法,具體內(nèi)容如下：1.基于β-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)作用,并結(jié)合核酸催化動(dòng)力學(xué)組裝發(fā)展了一種靈敏檢測(cè)DNA的方法。設(shè)計(jì)了一條5’末端標(biāo)芘的發(fā)夾探針H1和一條未標(biāo)記的發(fā)夾探針H2,沒(méi)有目標(biāo)DNA存在時(shí),兩條發(fā)夾探針能夠穩(wěn)定存在,末端芘很容易嵌入p-環(huán)糊精聚合物的空腔,引起熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)；有目標(biāo)DNA存在時(shí),可以觸發(fā)探針H1打開(kāi),并與探針H2雜交形成雙鏈H1/H2,此時(shí)芘在雙鏈的凹陷端,由于空間位阻較大不易嵌入p-環(huán)糊精聚合物空腔,熒光較弱。這一檢測(cè)方法探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便,無(wú)需復(fù)雜的熱循環(huán)過(guò)程,能實(shí)現(xiàn)DNA的靈敏檢測(cè),其檢測(cè)限為10pmol L-1,并且具有較好的選擇性。此外,該方法實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞裂解液中目標(biāo)DNA的檢測(cè),有望發(fā)展為一種通用的核酸檢測(cè)方法。2.基于p-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)效果并結(jié)合催化發(fā)夾組裝,建立了一種腺苷的熒光檢測(cè)方法。設(shè)計(jì)了一條5’末端標(biāo)芘的發(fā)夾探針H1和一條未標(biāo)記的發(fā)夾探針H2,一條雙鏈探針Aptamer-trigger/Inhibitor。無(wú)目標(biāo)物腺苷存在時(shí),各探針?lè)�(wěn)定存在,發(fā)夾探針末端芘很容易嵌入β-環(huán)糊精聚合物空腔,熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)；當(dāng)有腺苷存在時(shí),腺苷與aptamer序列結(jié)合,將Inhibitor鏈競(jìng)爭(zhēng)下來(lái),暴露出trigger序列可以與發(fā)夾探針H1雜交,打開(kāi)發(fā)夾探針H1,繼而打開(kāi)發(fā)夾探針H2形成雙鏈復(fù)合物H1/H2,同時(shí)釋放出trigger進(jìn)行循環(huán)。此時(shí)芘在雙鏈的凹陷端,由于空間位阻不易嵌入p-環(huán)糊精聚合物,熒光信號(hào)較弱。本方法只需在探針上標(biāo)記單個(gè)芘,探針易于設(shè)計(jì),無(wú)需昂貴的酶試劑,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便,實(shí)現(xiàn)了腺苷的靈敏檢測(cè),檢測(cè)限為42 nmol L-1,并且具有良好的選擇性,還實(shí)現(xiàn)人血清中腺苷的檢測(cè)。3.基于p-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)作用,并結(jié)合核酸外切酶III的信號(hào)放大技術(shù),發(fā)展了一種靈敏檢測(cè)DNA的方法。檢測(cè)體系中包含一條發(fā)夾探針(芘標(biāo)記在莖部的中間位置一個(gè)堿基上)、ExoⅢ、環(huán)糊精聚合物。當(dāng)有目標(biāo)DNA存在下,DNA能與發(fā)夾探針雜交并形成雙鏈的構(gòu)型,ExoⅢ能逐步酶切不斷產(chǎn)生標(biāo)芘的單個(gè)核苷酸。單個(gè)核苷酸上標(biāo)記的芘很容易嵌入到環(huán)糊精聚合物疏水的空腔,熒光信號(hào)得到顯著的增強(qiáng)。此時(shí)目標(biāo)DNA可以被釋放出來(lái),重新與其他發(fā)夾探針雜交,引起熒光信號(hào)的不斷放大,實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的靈敏檢測(cè)。本方法與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比,不需要標(biāo)記淬滅基團(tuán),設(shè)計(jì)新穎,靈敏度和選擇性均較好,對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限為17 pmol L~(-1)。
【關(guān)鍵詞】：核酸探針 信號(hào)放大 DNA β-環(huán)糊精聚合物 腺苷
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 本文所用英文縮寫(xiě)詞表12-13
• 第1章 緒論13-28
• 1.1 酶輔助的核酸探針檢測(cè)技術(shù)13-21
• 1.1.1 聚合酶輔助的核酸探針技術(shù)14-17
• 1.1.2 切刻酶輔助的核酸探針技術(shù)17-18
• 1.1.3 限制性內(nèi)切酶輔助的核酸探針技術(shù)18-19
• 1.1.4 連接酶輔助的核酸探針技術(shù)19-20
• 1.1.5 核酸外切酶輔助的核酸探針技術(shù)20-21
• 1.2 無(wú)酶輔助的核酸探針技術(shù)21-27
• 1.2.1 催化發(fā)夾組裝技術(shù)22-23
• 1.2.2 雜交鏈?zhǔn)椒糯蠹夹g(shù)23-24
• 1.2.3 核酶探針技術(shù)24-25
• 1.2.4 基于納米材料的核酸探針技術(shù)25-26
• 1.2.5 基于雙鏈替換反應(yīng)的核酸探針技術(shù)26-27
• 1.3 本文擬開(kāi)展的研究工作27-28
• 第2章 基于催化發(fā)夾組裝與β-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)作用用于DNA的檢測(cè)28-41
• 2.1 前言28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分29-32
• 2.2.1 主要試劑和儀器29
• 2.2.2 合成β-環(huán)糊精聚合物29-30
• 2.2.3 可行性考察30
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化30-31
• 2.2.5 定量檢測(cè)31
• 2.2.6 Target DNA選擇性考察31
• 2.2.7 電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證31
• 2.2.8 實(shí)際樣品中Target DNA的檢測(cè)31-32
• 2.2.9 延長(zhǎng)序列Prolonged DNA的檢測(cè)32
• 2.3 結(jié)果與討論32-40
• 2.3.1 檢測(cè)原理32
• 2.3.2 可行性的驗(yàn)證32-34
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化34-38
• 2.3.4 定量檢測(cè)38
• 2.3.5 選擇性的考察38-39
• 2.3.6 實(shí)際樣品中Target DNA的檢測(cè)39-40
• 2.3.7 延長(zhǎng)序列Prolonged DNA的檢測(cè)40
• 2.4 小結(jié)40-41
• 第3章 基于催化發(fā)夾組裝與β-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)作用用于腺苷的檢測(cè)41-53
• 3.1 前言41-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分42-45
• 3.2.1 主要試劑和儀器42
• 3.2.2 可行性考察42-43
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化43-44
• 3.2.4 腺苷定量檢測(cè)44
• 3.2.5 選擇性考察44
• 3.2.6 血清中的腺苷檢測(cè)44
• 3.2.7 電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證44-45
• 3.3 結(jié)果與討論45-52
• 3.3.1 檢測(cè)原理45
• 3.3.2 可行性考察45-46
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化46-50
• 3.3.4 腺苷定量檢測(cè)50-51
• 3.3.5 選擇性考察51-52
• 3.3.6 血清中的腺苷檢測(cè)52
• 3.4 小結(jié)52-53
• 第4章 基于酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大與β-環(huán)糊精聚合物對(duì)芘的熒光增強(qiáng)作用用于DNA的檢測(cè)53-63
• 4.1 前言53-54
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分54-56
• 4.2.1 主要試劑和儀器54
• 4.2.2 可行性考察54
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化54-55
• 4.2.4 DNA的定量檢測(cè)55
• 4.2.5 選擇性考察55
• 4.2.6 電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證55-56
• 4.3 結(jié)果與討論56-62
• 4.3.1 檢測(cè)原理56
• 4.3.2 可行性驗(yàn)證56-57
• 4.3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化57-60
• 4.3.4 DNA定量檢測(cè)60-61
• 4.3.5 選擇性考察61-62
• 4.4 小結(jié)62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-86
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄86-87
• 致謝87

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