本文關(guān)鍵詞：多肽與寡核苷酸偶聯(lián)純化方法及功能化寡核苷酸的應(yīng)用研究

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【摘要】：寡核苷酸是一類短鏈核苷酸,其具有很強(qiáng)的生物活性。通過指數(shù)富集的配基進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選出能與蛋白、小分子、離子、細(xì)胞等受體特異性結(jié)合的寡核苷酸具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),能用于各種生物傳感。同時,寡核苷酸可作為基因治療藥物或藥物前體。但寡核苷酸具有細(xì)胞通透性差、易被分解且與目標(biāo)物親和力不強(qiáng)的缺點(diǎn)。而多肽具有分子量小,帶電量可調(diào),抗酶水解等特點(diǎn),將兩者進(jìn)行偶聯(lián)既可以提高細(xì)胞的通透性還可以提高寡核苷酸的生物活性。近年來各種多肽篩選技術(shù)尤其是噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展,使得一大批具有識別、檢測和治療癌細(xì)胞功能的多肽不斷出現(xiàn)。這些多肽的發(fā)現(xiàn)給各種癌癥的診斷、治療帶來了新的思路和方法。將多肽與寡核苷酸進(jìn)行有效地連接,可得到具有雙功能的生物分子,或具有協(xié)同治療作用能實現(xiàn)診療一體化的藥物。故多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物(POCs),在生物傳感和癌癥治療方面都具有很高的實際應(yīng)用價值。基于以上原因,本文開展了以下的工作：1、利用了Click反應(yīng),EDC-NHS交聯(lián)羧基與巰基的直接偶聯(lián)法和偶聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP),4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-SMCC)偶聯(lián)的方法合成了不同性質(zhì)的多肽與寡核苷酸的偶聯(lián)物,在合成過程中對合成各條件進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),來提高反應(yīng)效率。從理論和實踐中探討對合成效率有關(guān)鍵性影響的因素。討論了不同偶聯(lián)方法在合成多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物中的優(yōu)缺點(diǎn),并指出各種方法適用范圍及最適的反應(yīng)條件。2、為了尋求一種快速、高效、規(guī)�；�、標(biāo)準(zhǔn)化分離提純多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物的方法,我們利用高效液相色譜(HPLC)、離子交換色譜(IEC)、聚丙烯酰胺凝膠切膠回收、透析、超濾、核酸酶酶切等方法將合成好的混合物進(jìn)行提純,針對各種提純方法的特點(diǎn)進(jìn)行討論并將其用于改進(jìn)純化過程。對純化過程中遇到的各種問題進(jìn)行分析和討論,總結(jié)給出了各種分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)。最后,結(jié)合實驗原理和結(jié)果對各種方法的適用條件和范圍給出了合理的建議。該結(jié)果對以后純化不同POCs給出了明確的指導(dǎo)和建議。3、利用一條帶有BHQ1熒光淬滅基團(tuán)的DNA與對Pb~(2+)具有特異性的DNA酶鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對,當(dāng)無Pb~(2+)存在時向溶液中加入超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)。由于正負(fù)電荷的吸引作用scGFP與DNA雙鏈靠近,綠色熒光蛋白的熒光被BHQ1淬滅。當(dāng)存在Pb~(2+)時,Pb~(2+)能特異性識別DNA雙鏈中含有RNA的位點(diǎn)并將其切割,切割后的含有BHQ1的短鏈DNA從雙鏈上脫離并游離到溶液,此時再加入scGFP,游離到溶液中的BHQ1無法淬滅scGFP的熒光導(dǎo)致scGFP的熒光恢復(fù)。實現(xiàn)了一種熒光"turn on"的Pb~(2+)響應(yīng)的平臺,并用于高效檢測Pb~(2+)。
【關(guān)鍵詞】：寡核苷酸 多肽 偶聯(lián) 純化 Pb~(2+)特異性DNA酶 超電荷綠色熒光蛋白
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q52;O652
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-26
• 1.1 多肽-寡核苷酸偶聯(lián)12-17
• 1.1.1 片段合成法13-16
• 1.1.2 固相逐步合成法16-17
• 1.1.3 生化-酶偶聯(lián)合成法17
• 1.2 多肽-寡核苷酸分離提純17-19
• 1.2.1 基于色譜法的分離17-18
• 1.2.2 基于電泳法的分離18-19
• 1.3 多肽-寡核苷酸偶聯(lián)物的應(yīng)用19-24
• 1.3.1 在治療方面的應(yīng)用19-23
• 1.3.2 作為模型進(jìn)行機(jī)理研究23-24
• 1.3.3 作為人工酶24
• 1.4 本文構(gòu)思24-26
• 第2章 多肽與寡核苷酸偶聯(lián)方法的研究26-39
• 2.1 前言26-28
• 2.2 實驗部分28-30
• 2.2.1 實驗試劑與設(shè)備28-29
• 2.2.2 通過疊氮基與炔基的方法合成POCs29
• 2.2.3 通過EDC-NHS的方法合成POCs29
• 2.2.4 通過交聯(lián)劑SPDP的方法合成POCs29
• 2.2.5 通過交聯(lián)劑Sulfo-SMCC的方法合成POCs29
• 2.2.6 紫外-分光光度法初步測定DNA濃度29-30
• 2.2.7 變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠分析偶聯(lián)產(chǎn)物30
• 2.3 結(jié)果與討論30-37
• 2.3.1 各類合成條件的優(yōu)化30-36
• 2.3.2 各類合成方法的優(yōu)缺點(diǎn)36-37
• 2.4 本章小結(jié)37-39
• 第3章 多肽與寡核苷酸偶聯(lián)物分離方法的研究39-51
• 3.1 前言39
• 3.2 實驗部分39-41
• 3.2.1 實驗儀器與試劑39-40
• 3.2.2 反向高效液相色譜法用于POCs的分離40
• 3.2.3 離子交換色譜法用于POCs的分離40
• 3.2.4 凝膠電泳法用于POCs的分離40-41
• 3.2.5 透析的方法用于POCs的分離41
• 3.2.6 超濾的方法用于POCs的分離41
• 3.2.7 核酸酶水解方法用于POCs的分離41
• 3.3 結(jié)果與討論41-50
• 3.3.1 反向高效液相色譜方法在分離POCs中的條件分析和優(yōu)化41-43
• 3.3.2 離子交換色譜方法在分離POCs中的條件分析和優(yōu)化43-45
• 3.3.3 凝膠電泳方法在分離POCs中的條件分析和優(yōu)化45-46
• 3.3.4 透析方法分離在POCs中的條件分析和優(yōu)化46
• 3.3.5 超濾方法在分離POCs的條件分析和優(yōu)化46-47
• 3.3.6 核酸水解方法在分離POCs中的條件分析和優(yōu)化47-48
• 3.3.7 以上純化方法的比較和總結(jié)48-50
• 3.4 本章小結(jié)50-51
• 第4章 基于超電荷綠色熒光蛋白與DNA酶高選擇熒光檢測Pb~(2+)51-60
• 4.1 前言51-52
• 4.2 實驗部分52-53
• 4.2.1 實驗儀器與試劑52
• 4.2.2 酶切反應(yīng)52
• 4.2.3 熒光檢測52-53
• 4.2.4 變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠分析酶切效率53
• 4.3 實驗結(jié)果與討論53-58
• 4.3.1 DNAzyme與scGFP平臺檢測Pb~(2+)實驗原理53-54
• 4.3.2 DNAzyme與scGFP平臺用于檢測Pb~(2+)的可行性分析54-55
• 4.3.3 DNA長度的優(yōu)化55
• 4.3.4 酶切體系的優(yōu)化55-56
• 4.3.5 檢測體系的優(yōu)化56-57
• 4.3.6 不同Pb~(2+)濃度的響應(yīng)57
• 4.3.7 scGFP-DNAzymes平臺對Pb~(2+)響應(yīng)的選擇性57-58
• 4.3.8 scGFP-DNAzymes平臺用于實際樣品中Pb~(2+)的檢測58
• 4.4 小結(jié)58-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-73
• 附錄 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄73-74
• 致謝74-75

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本文編號：988764