本文關鍵詞：布魯氏菌免疫磁珠及免疫熒光檢測方法的研究

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【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的重要的人獸共患傳染病之一,屬于二類傳染病。上世紀80年代以來,隨著我國畜牧業(yè)迅猛蓬勃發(fā)展,使我國家畜布魯氏菌病的流行以及對人的危害有所加重。近些年,布魯氏菌病的大規(guī)模爆發(fā)極少,以小范圍爆發(fā)為主,較分散,這給防治工作帶來較大困難。布魯氏菌病嚴重威脅人類的健康,同時影響著乳品、肉類等畜牧產業(yè),給動物性食品安全和公共衛(wèi)生安全帶來很大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)檢測動物源性食品中布魯氏菌程序復雜,耗時耗力,免疫磁性分離技術是將免疫學反應的高度特異性與磁珠特有的磁響應性相結合的一種新的免疫學技術,可以有效收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,對目的菌分離具有高分離率、高特異性、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備等特點。因此本研究擬建立布魯氏菌免疫磁性分離技術,并研究其在動物源性食品檢測中的應用。本研究利用PCR方法從羊種布魯氏菌疫苗株M5菌株基因組中擴增到表面蛋白基因bcsp31,克隆至載體pJET1.2,然后亞克隆至原核表達載體pET28a,構建出重組表達質粒pET28a-bcsp31,并將其轉化至表達菌BL21(DE3)。經IPTG誘導后,表達出了31kDa的重組蛋白。重組BCSP31蛋白呈可溶性表達,表達量約占細菌可溶性蛋白46.3%。通過Ni-NTA親和層析純化了重組蛋白,純化后的蛋白純度約為94.7%。對BCSP31蛋白的免疫原性實驗結果表明,重組蛋白免疫小鼠血清抗體效價可達1:16 000以上,重組蛋白免疫小鼠血清與布魯氏菌呈均陽性反應,說明表達的重組蛋白具有良好的免疫原性。用重組蛋白BCSP31和羊種布魯氏菌疫苗株M5分別免疫家兔,獲得布魯氏菌多克隆抗體,制備免疫磁珠,并對制備條件進行優(yōu)化,最終確定磁珠活化時間45 min,最佳抗體體積500μL,最佳偶聯(lián)時間14 h,最佳磁珠用量20μL,最佳富集時間30 min,最佳洗滌液pH值7.4。分別用蛋白免疫抗體和羊布魯氏菌M5免疫抗體包被磁珠,對10~109 CFU/mL的9個濃度梯度的羊種布魯氏菌疫苗株M5菌液進行捕獲,涂TSB平板,37℃培養(yǎng)5 d后挑取疑似菌落進行PCR鑒定,結果顯示蛋白免疫抗體包被磁珠的檢測限為104 CFU/m L,菌體免疫抗體包被磁珠的檢測限為10 CFU/mL,說明布魯氏菌菌體免疫抗體包被磁珠效果好于重組蛋白免疫抗體包被磁珠。用免疫磁珠對牛種布魯氏菌弱毒株45/20、豬種布魯氏菌疫苗株S2菌液進行捕獲,結果顯示免疫磁珠對不同種的布魯氏菌均可檢測。用羊種布魯氏菌疫苗株M5對牛奶和肉類樣品進行人工模擬污染后,用免疫磁珠集菌后進行涂板培養(yǎng),結果顯示對污染樣品的檢測限為103CFU/mL,而直接用PCR進行檢測的下限為104 CFU/m L,說明免疫磁珠結合平板培養(yǎng)的方法,不僅檢測敏感性高于PCR方法,還可以直接分離到污染樣品中的布魯氏菌。本研究還利用獲得的布魯氏菌多克隆抗體建立了布魯氏菌間接免疫熒光檢測技術,最終確定一抗二抗稀釋倍數均為1:40,對不同濃度的羊種布魯氏菌疫苗株M5菌液進行間接免疫熒光實驗,在熒光顯微鏡下觀察,最低可在105 CFU/mL濃度的菌液中觀察到呈特異性熒光的布魯氏菌菌體,還可在2 h內完成動物臟器中布魯氏菌的檢測。綜合研究結果表明,成功表達了布魯氏菌BCSP31重組蛋白,該重組蛋白具有良好的免疫原性,以重組蛋白和布魯氏菌菌體包被ELISA板,與免疫小鼠血清均呈陽性反應。用免疫抗體包被磁珠,建立了布魯氏菌免疫磁珠檢測方法,不僅檢測敏感性提高,還可分離樣品中的布魯氏菌。間接免疫熒光法可以快速排查布魯氏菌,大大節(jié)省實驗時間,若將兩種方法結合起來,則能更有效的檢測樣品中的布魯氏菌,為市場檢疫提供更為便捷的檢驗方法,對于重大衛(wèi)生事件爆發(fā)的應急檢測,也有著重大意義。
【關鍵詞】：布魯氏菌 BCSP31 表面蛋白 克隆表達 免疫熒光 免疫磁珠
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TS207.4;O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-18
• 1.1 布魯氏菌9
• 1.2 布魯氏菌病9-10
• 1.3 布魯氏菌病的流行現(xiàn)狀10
• 1.4 布魯氏菌檢測方法10-13
• 1.5 布魯氏菌外膜蛋白研究進展13-14
• 1.6 免疫磁性分離技術14-15
• 1.7 研究目的與意義15-16
• 1.8 研究創(chuàng)新點16
• 1.9 研究內容16-18
• 2 材料與方法18-35
• 2.1 材料18-20
• 2.2 方法20-35
• 3 結果與分析35-47
• 3.1 重組表達質粒pET28a-bcsp31的構建35-36
• 3.2 重組蛋白BCSP31的表達與純化36-38
• 3.3 重組蛋白BCSP31免疫原性研究38-40
• 3.4 布魯氏菌間接免疫熒光檢測技術的建立40-43
• 3.5 布魯氏菌免疫磁性分離技術的建立43-45
• 3.6 免疫磁珠檢測模擬污染樣品中的布魯氏菌45-47
• 4 討論47-49
• 4.1 布魯氏菌bcsp31基因的克隆表達47
• 4.2 布魯氏菌BCSP31蛋白的免疫原性研究47
• 4.3 布魯氏菌間接免疫熒光檢測技術的建立47-48
• 4.4 布魯氏菌免疫磁性分離技術的建立48-49
• 5 結論49-50
• 5.1 成功表達出布魯氏菌表面蛋白BCSP3149
• 5.2 表達的重組蛋白BCSP31具有良好的免疫原性49
• 5.3 建立了布魯氏菌間接免疫熒光檢測技術49
• 5.4 建立了布魯氏菌免疫磁性分離技術49-50
• 參考文獻50-56
• 作者簡介56-57
• 致謝57

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