本文關(guān)鍵詞：通過定向進化和半理性設(shè)計提高順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的熱穩(wěn)定性的研究

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【摘要】：順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase)是一種環(huán)氧化物水解酶(sEHs, EC 3.3.2.10)。其功能是不借助輔因子或金屬離子催化環(huán)氧琥珀酸的環(huán)氧鍵的水解,形成特定手性的酒石酸。本文研究的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶催化產(chǎn)生L(+)-酒石酸。此類cis-epoxysuccinate hydrolase (CESH)存在于多種微生物體內(nèi),如根瘤菌(Rhizobium)、假單胞菌(Pseudomonas)、諾卡式菌(Nocardia)、棒狀桿菌(Corynebacterium)和紅球菌(Rhodococcus)。CESH在工業(yè)上得到了應(yīng)用,其優(yōu)點在于催化效率高,立體選擇性好。但目前工業(yè)生產(chǎn)所用的CESH自身的穩(wěn)定性差,催化劑的使用壽命較短,提高CESH的穩(wěn)定性可以進一步提高工業(yè)生產(chǎn)的效率。本研究選取目前工業(yè)生產(chǎn)所使用的來自紅球菌(Rhodococcus)頃式環(huán)氧琥珀酸水解酶,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后合成該基因(GenBank DQ471957),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET8a(+)-CESH;轉(zhuǎn)入宿主菌E. coli BL21(DE3),構(gòu)建工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CESH;使用IPTG誘導表達,分析其活性及熱穩(wěn)定性。野生型CESH的比活力為76.5 U/mg,其50℃下的半衰期(t1/2,50℃)為8.5 mmin,其T5015(酶在該溫度下15 mmin內(nèi)喪失50%活力)為44.0℃。設(shè)計了針對該酶熱穩(wěn)定性的高通量篩選方法,優(yōu)化了易錯PCR的反應(yīng)條件。經(jīng)定向進化改造,得到一株突變體1X-1(Q122R),比活力為75.8 U/mg,t1/2,50℃為31.6 min,T5015為49.5℃。在此基礎(chǔ)上,以突變體1X-1為母本進行進一步的定向進化改造,均未能得到更好的突變體有益突變,改造受阻。因此,研究轉(zhuǎn)向選擇半理性設(shè)計思路對CESH進行進一步的改造。以突變體1X-1為母本,利用“多重序列對比”手段預測可能對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性有利的氨基酸替換方式,得到兩株熱穩(wěn)定性較高的突變子,2X-2(Q122R,F26V)釉2X-4(Q122R, I83R)。突變體2X-2的比活力為76.1 U/mg,t1/2,50℃為162.1 min, T5015為54.6℃。突變體2X-4的比活力為74.3 U/mg, t1/2,50℃為44.0 min,T5015為50.4℃。利用定點突變將突變體2X-2和2X-4的突變位點結(jié)合在一起,得到突變體3X (Q122R,F26V, I83R),其比活力為75.5 U/mg,t1/2,50℃為170.8 min, T5015為55.4℃。以突變體3X為母本,利用“計算機模擬突變”預測能提高其熱穩(wěn)定性的氨基酸替換方式,得到了具有更高熱穩(wěn)定性的兩株突變體,4X-4 (Q122R, F26V, I83R, D8K)和4X-6 (Q122R, F26V, I83R, S90R)。突變體4X-1的比活力為75.8 U/mg,t1/2,50℃為225.2 min,死015為61.6℃。突變體4X-6的比活力為75.2 U/mg, t1/2,50℃為180.5 min, T5015為56.5℃。將突變體4X-1和4X-6的突變位點結(jié)合在一起,得到了突變體5X (Q122R, F26V, I83R,D8K, S90R),其比活力為74.3 U/mg, t1/2,50℃為237.1 min, T5015為62.4℃。以突變體5X為母本,在其8位點,26位點,83位點,90位點和122位點上分別進行定點飽和突變,篩選出一株帶有更高熱穩(wěn)定性的突變體5X-1 (Q122R, F26W, I83R, D8K, S90R),其比活力為75.1 U/mg, t1/2, 50℃為293.2 min,T5015為64.8℃。相較于野生型CESH,突變體5X-1的催化效率沒有明顯下降,并且具有極高的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性。突變體5X-1在50℃下酶活力的半衰期提高了33.5倍,T5015則提高了20℃；最適pH值范圍則由野生型的8.0-9.0擴展到了5.0-10.0,大大提高了酶的pH值耐受性。另外,將突變體5X-1固定化后所得的生物催化劑的活力較固定化野生酶提高了一倍；并且固定化野生型CESH在37℃,45℃和50℃下的半衰期分別是13天,5天和2天,而固定化突變子5X-1的半衰期在50℃和45℃下分別為25天和35天,在37℃下反應(yīng)38天后仍殘余65%的活力,使用壽命得到了極大的延長。
【關(guān)鍵詞】：順式環(huán)氧琥珀酸水解酶 重組大腸桿菌 定向進化 半理性設(shè)計
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文獻綜述12-28
• 1.1 引言12-17
• 1.1.1 L(+)-酒石酸生產(chǎn)方式12-13
• 1.1.2 酶催化法的研究進展13-15
• 1.1.3 順式還氧琥珀酸水解酶的可溶性表達15
• 1.1.4 順式還氧琥珀酸水解酶的適宜溫度15-16
• 1.1.5 提高CESH的熱穩(wěn)定性16-17
• 1.2 定向進化17-21
• 1.2.1 定向進化技術(shù)的原理17-18
• 1.2.2 定向進化的思路18
• 1.2.3 建立突變文庫18-21
• 1.2.4 建立高通量篩選方法21
• 1.3 半理性設(shè)計21-26
• 1.3.1 基于結(jié)構(gòu)信息的靶向隨機突變22-25
• 1.3.2 基于蛋白質(zhì)序列同源性的改造25-26
• 1.4 課題研究的研究思路26-28
• 第二章 實驗材料與方法28-42
• 2.1 菌種和質(zhì)粒28-29
• 2.2 儀器和工具29-31
• 2.2.1 主要儀器29
• 2.2.2 工具酶及主要試劑29-31
• 2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件31
• 2.3.1 定點突變和酶活性測定所用31
• 2.3.2 定向進化所用31
• 2.4 實驗分析方法31-42
• 2.4.1 pH值的測定31
• 2.4.2 菌體濃度測定31
• 2.4.3 瓊脂糖凝膠電泳31-32
• 2.4.4 質(zhì)粒的提取32-33
• 2.4.5 大腸桿菌超聲破碎方法33
• 2.4.6 SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳實驗33-35
• 2.4.7 蛋白的純化35-36
• 2.4.8 蛋白濃度的測定36
• 2.4.9 CESH酶學性質(zhì)的測定36-37
• 2.4.10 感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化37-42
• 第三章 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶CESH表達體系優(yōu)化42-54
• 3.1 引言42
• 3.2 實驗方法42-44
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒42
• 3.2.2 基本培養(yǎng)條件42-43
• 3.2.3 工具酶及主要試劑43
• 3.2.4 質(zhì)粒DNA的提取43
• 3.2.5 DNA的檢測以及切膠回收43
• 3.2.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建43-44
• 3.2.7 構(gòu)建重組菌44
• 3.3 結(jié)果與討論44-52
• 3.3.1 CESH結(jié)構(gòu)基因的密碼子優(yōu)化44-45
• 3.3.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒45-46
• 3.3.3 重組質(zhì)粒pET28a(+)-CESH的構(gòu)建46-47
• 3.3.4 重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-CESH的構(gòu)建47-49
• 3.3.5 搖瓶中不同重組菌誘導條件優(yōu)化及比較49-51
• 3.3.6 96孔板中工程菌培養(yǎng)、誘導條件的優(yōu)化51-52
• 3.4 小結(jié)52-54
• 第四章 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶CESH的定向進化54-66
• 4.1 引言54
• 4.2 菌株、質(zhì)粒和酶54-55
• 4.3 建立突變率穩(wěn)定的突變文庫55-60
• 4.3.1 不同PCR循環(huán)下的突變率控制55-56
• 4.3.2 使用無自檢能力的Taq聚合酶56-59
• 4.3.3 使用高保真Pfu聚合酶59-60
• 4.4 感受態(tài)細胞的選擇60-62
• 4.5 高通量篩選62-64
• 4.6 小結(jié)64-66
• 第五章 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶CESH的半理性設(shè)計66-78
• 5.1 引言66
• 5.2 基于MSAs的設(shè)計與改造66-68
• 5.3 基于同源模建的設(shè)計與改造68-71
• 5.3.1 CESH同源模建68-70
• 5.3.2 計算機模擬突變70-71
• 5.4 定點飽和突變71-74
• 5.5 突變子5x-1的性質(zhì)分析74-77
• 5.5.1 突變子5X-1環(huán)境抗逆性74-75
• 5.5.2 固定化下突變子5X-1和野生型CESH的比較75-77
• 5.6 小結(jié)77-78
• 第六章 總結(jié)和展望78-80
• 6.1 總結(jié)78-79
• 6.2 展望79-80
• 參考文獻80-88
• 攻讀碩士學位論文期間研究成果88
• 已發(fā)表論文88
• 申報專利88

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本文編號：967650