本文關(guān)鍵詞：聚乙烯亞胺對辣根過氧化物酶與乳酸脫氫酶構(gòu)象和活性的影響

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【摘要】：近年來,聚乙烯亞胺(PEI)基因載體材料由于其良好的轉(zhuǎn)染效率而備受基因工程界的青睞,但其潛在的安全性理論依據(jù)尚不明確,尤其是對功能性蛋白(如酶)的影響機理還缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。本文運用紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜等光譜學(xué)手段,酶促反應(yīng)動力學(xué)方法以及ITC技術(shù)研究了聚乙烯亞胺對辣根過氧化物酶(HRP)和乳酸脫氫酶(LDH)的構(gòu)象、催化活性、熱穩(wěn)定性以及酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響,對PEI與兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用機理進行了探討,為PEI作為基因載體材料的安全性研究提供一定的理論依據(jù)。本研究結(jié)果如下：PEI對HRP的構(gòu)象和功能均有顯著影響。(1)PEI的存在主要影響蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu),對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響程度有限,對于構(gòu)象的影響可能是PEI與HRP形成了復(fù)合物,引起肽鏈骨架發(fā)生變化,色氨酸和酪氨酸殘基附近微區(qū)環(huán)境的疏水性及兩種氨基酸在極性環(huán)境中的暴露程度發(fā)生了改變；(2)PEI可以增強HRP在模擬生理溶液中的催化活性,同時其酶催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax也發(fā)生了變化,但其耐高溫能力有所削弱；(3)根據(jù)ITC結(jié)果顯示PEI與HRP間的相互作用表現(xiàn)出顯著的熱效應(yīng),PEI與HRP間相互作用過程中,第一步△H10,AS10,而第二步△H20,△S20,故PEI與HRP之間的相互作用主要由疏水作用力、氫鍵和范德華力起主導(dǎo)作用。LDH在模擬生理溶液中的構(gòu)象和催化功能也因PEI的存在發(fā)生了明顯變化。(1)在30℃測定條件下,PEI的加入可使LDH的催化活性顯著降低,酶催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax也發(fā)生相應(yīng)變化,與此同時LDH的耐熱穩(wěn)定性也出現(xiàn)明顯削弱；(2)與HRP不同的是PEI的加入不僅導(dǎo)致LDH二級結(jié)構(gòu)增強,同時三級結(jié)構(gòu)也有顯著影響,色氨酸和酪氨酸殘基附近微區(qū)環(huán)境變化十分劇烈,兩種氨基酸基團在極性溶劑中的暴露程度也有所改變,LDH與PEI之間很可能形成了復(fù)合物；(3)從ITC結(jié)果來看,PEI與LDH結(jié)合的過程為一個吸熱過程,其△H0,AS0,說明PEI與LDH之問的相互作用主要為疏水相互作用,并且是一個熵驅(qū)動的過程。
【關(guān)鍵詞】：聚乙烯亞胺 辣根過氧化物酶 乳酸脫氫酶 構(gòu)象變化 相互作用 催化活性 熱穩(wěn)定性 熱力學(xué)參數(shù)
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8;O643.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 符號說明11-12
• 第一章 緒論12-25
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 聚乙烯亞胺基因載體材料13-14
• 1.3 聚乙烯亞胺與蛋白質(zhì)相互作用研究進展14-15
• 1.4 辣根過氧化物酶15-19
• 1.5 乳酸脫氫酶19-21
• 1.6 選題思路及主要內(nèi)容21-25
• 1.6.1 研究思路21-23
• 1.6.2 主要內(nèi)容23-25
• 第二章 聚乙烯亞胺對辣根過氧化物酶構(gòu)象和活性的影響25-45
• 2.1 引言25
• 2.2 試驗部分25-30
• 2.2.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備25-26
• 2.2.2 儲備液的配制26-27
• 2.2.3 紫外光譜掃描27-28
• 2.2.4 圓二色譜測定28
• 2.2.5 熒光光譜的檢測28
• 2.2.6 辣根過氧化物酶的活性測定28-29
• 2.2.7 辣根過氧化物酶的熱穩(wěn)定性檢測29
• 2.2.8 反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定29-30
• 2.2.9 ITC30
• 2.3 結(jié)果與討論30-44
• 2.3.1 紫外吸收光譜30-31
• 2.3.2 圓二色譜31-32
• 2.3.3 熒光光譜32-37
• 2.3.4 等溫滴定量熱分析37-40
• 2.3.5 PEI對HRP催化活性的影響40-41
• 2.3.6 酶促反應(yīng)動力學(xué)分析41-43
• 2.3.7 PEI對HRP熱穩(wěn)定性的影響43-44
• 2.4 本章小結(jié)44-45
• 第三章 聚乙烯亞胺對乳酸脫氫酶構(gòu)象和活性的影響45-65
• 3.1 引言45-46
• 3.2 試驗部分46-49
• 3.2.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備46
• 3.2.2 溶液的配制46-47
• 3.2.3 紫外光譜檢測47
• 3.2.4 圓二色譜掃描47
• 3.2.5 熒光光譜的測定47-48
• 3.2.6 乳酸脫氫酶的活性測定48
• 3.2.7 乳酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性檢測48
• 3.2.8 反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定48-49
• 3.2.9 ITC49
• 3.3 結(jié)果與討論49-63
• 3.3.1 紫外吸收光譜49-51
• 3.3.2 圓二色譜51-52
• 3.3.3 熒光光譜52-57
• 3.3.4 等溫滴定量熱分析57-60
• 3.3.5 PEI對LDH催化活性的影響60-61
• 3.3.6 酶促反應(yīng)動力學(xué)分析61-62
• 3.3.7 PEI對LDH熱穩(wěn)定性的影響62-63
• 3.4 本章小結(jié)63-65
• 第四章 結(jié)論與展望65-67
• 4.1 結(jié)論65-66
• 4.2 展望66-67
• 參考文獻67-79
• 致謝79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄80

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