本文關(guān)鍵詞：基于切割反應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶

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【摘要】：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族是一類鋅離子依賴型內(nèi)肽酶,其主要功能是消化特定的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲等活動(dòng)中起著重要作用。由于同腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲有密切的關(guān)系,MMPs在腫瘤早期診斷和預(yù)后檢測(cè)中常被作為生物標(biāo)志物,如MMP2和MMP9在前列腺癌及乳腺癌中呈現(xiàn)出高表達(dá),可以作為前列腺癌和乳腺癌初期診斷的標(biāo)示物。另外,某些蛋白酶、酶激活劑或酶抑制劑可以加快腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程,作為藥物用于腫瘤的治療,如和蛋白酶相對(duì)應(yīng)的特定底物多肽與經(jīng)典的抗癌藥物經(jīng)化學(xué)連接得到低毒且具有靶向性的抗癌藥物。因此,建立超靈敏、快速簡便的單組分、多組分可視化的基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)新方法,對(duì)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性疾病的早期診斷和藥物篩選等具有重要意義。電化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence, ECL)是對(duì)電極施加一定的電壓,進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)。通過反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某組分或者反應(yīng)產(chǎn)物之間進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的一種光輻射現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光的信號(hào)檢測(cè)的檢測(cè)器主要有光電倍增管和CCD。由于電化學(xué)發(fā)光分析法的靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性范圍寬、易于微型化,其在食品檢驗(yàn)、生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域都引起了人們的廣泛關(guān)注。以由固相合成法得到的多肽為分子識(shí)別物質(zhì),和抗體相比,具有環(huán)境耐受性好、合成成本低、分子量小以及極強(qiáng)的生物活性等優(yōu)點(diǎn),在生物標(biāo)志物的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。本論文提出以肽為MMPs的識(shí)別底物,以電化學(xué)發(fā)光試劑釕聯(lián)吡啶衍生物和新型銥金屬配合物為信號(hào)物質(zhì),基于切割反應(yīng)原理構(gòu)建超靈敏型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器,用于基質(zhì)金屬蛋白酶的定量檢測(cè)以及抑制劑的篩選�；诓煌盘�(hào)物質(zhì)發(fā)光電位的不同,設(shè)計(jì)電位分辨型的電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器用于多種基質(zhì)金屬蛋白酶的聯(lián)合檢測(cè)。本論文由引言和研究報(bào)告兩部分內(nèi)容組成。第一部分為引言部分,簡要介紹了基質(zhì)金屬蛋白酶的定義、分類、作用以及功能,概述了基于多肽的電化學(xué)發(fā)光方法在生物分析方面的應(yīng)用；著重綜述了幾類檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶活性的方法；最后闡明了本論文的研究思路,研究目的以及研究內(nèi)容。第二部分為研究報(bào)告,由以下兩部分組成：一、電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器檢測(cè)活細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶2。本研究工作中,利用基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)對(duì)底物多肽的識(shí)別作用,以釕聯(lián)吡啶衍生物(Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2,簡稱Ru1)為電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物,基于切割反應(yīng)原理建立了一種超靈敏檢測(cè)MMP-2的方法。將信號(hào)物通過共價(jià)連接的方式結(jié)合到底物肽上,形成電化學(xué)發(fā)光探針(Ru1-peptide)之后,通過探針多肽CGPLGVRGK的C端基上的巰基和金電極間的Au-S鍵作用自組裝到了金電極表面,得到了電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。當(dāng)目標(biāo)物MMP-2存在時(shí),它能夠選擇性切斷底物肽釋放電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物,在共反應(yīng)試劑TPA作用下,電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。結(jié)果表明,降低的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和MMP-2的濃度在1 ng/mL～50ng/mL和50 ng/mL～500ng/mL范圍內(nèi)分段成線性,其檢出限為0.7ng/mL。該方法簡單靈敏,且能夠應(yīng)用到活細(xì)胞分泌的MMP-2的檢測(cè),為臨床上疾病相關(guān)的其他基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測(cè)提供了一種新思路。二、電位分辨型電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器同時(shí)檢測(cè)MMP-7和MMP-2。本工作以基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2)和基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7)作為目標(biāo)物質(zhì),釕聯(lián)吡啶衍生物(Rul)和銥金屬配合物(Irl)作為兩種電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物,以各自的底物肽CGPLGVRGK和KRPLALWRSC為分子識(shí)別底物�；赗ul和Irl在金電極上電化學(xué)發(fā)光電位的不同,建立雙電位法同時(shí)檢測(cè)MMP-7和MMP-2的電化學(xué)發(fā)光分析方法。0.9 V處電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低值和MMP-2的濃度在10ng/mL～300ng/mL間有良好的線性關(guān)系；1.4V處電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低值和MMP-7的濃度在0.05ng/mL～1ng/mL之間呈良好的線性關(guān)系,檢出限分別為5 ng/mL和10pg/mL�；陔p電位響應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器為臨床診斷中復(fù)雜生物體系的研究提供了更多可能性,為多種腫瘤標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)提供了一種簡單、靈敏有特異性又可靠的方法。
【關(guān)鍵詞】：電化學(xué)發(fā)光 肽 基質(zhì)金屬蛋白酶2 基質(zhì)金屬蛋白酶7 雙電位
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-34
• 1.1 基質(zhì)金屬蛋白酶概述11-12
• 1.2 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光分析法12-19
• 1.2.1 電化學(xué)發(fā)光分析法概述12
• 1.2.2 肽的概述12-13
• 1.2.3 基于肽的電化學(xué)發(fā)光分析法13-19
• 1.3 基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測(cè)方法19-31
• 1.3.1 比色分析法20-21
• 1.3.2 熒光分析法21-25
• 1.3.3 電化學(xué)分析法25-30
• 1.3.4 其他分析方法30-31
• 1.4 本論文的研究目的以及研究內(nèi)容31-34
• 第2章 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器檢測(cè)活細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶234-52
• 2.1 引言34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分35-37
• 2.2.1 儀器與試劑35-36
• 2.2.2 電化學(xué)發(fā)光探針(Ru1-peptide)的合成36
• 2.2.3 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備36
• 2.2.4 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)MMP-236-37
• 2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)37
• 2.3 結(jié)果與討論37-50
• 2.3.1 電化學(xué)發(fā)光探針Ru1-peptide的表征37-39
• 2.3.2 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的表征39-40
• 2.3.3 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測(cè)MMP-2可行性分析40-43
• 2.3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化43-44
• 2.3.5 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的分析性能44-45
• 2.3.6 選擇性45-46
• 2.3.7 抑制劑的選擇46-47
• 2.3.8 樣品分析47-50
• 2.4 小結(jié)50-52
• 第3章 電位分辨型電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器同時(shí)檢測(cè)MMP-7和MMP-252-68
• 3.1 引言52-53
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分53-55
• 3.2.1 試劑和儀器53-54
• 3.2.2 電化學(xué)發(fā)光探針的合成54
• 3.2.3 基于多肽的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于MMP-7的檢測(cè)54-55
• 3.2.4 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器的構(gòu)建55
• 3.3 結(jié)果與討論55-66
• 3.3.1 Ir1的電化學(xué)發(fā)光行為55-59
• 3.3.2 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器的可行性59-63
• 3.3.3 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器的分析性能63-66
• 3.4 小結(jié)66-68
• 總結(jié)68-70
• 參考文獻(xiàn)70-82
• 致謝82-84
• 攻讀碩士期間主要研究成果84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 舒筱燦;王喜梅;王蕾;;基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2009年11期

2 劉豐彬;段立公;;基質(zhì)金屬蛋白酶研究進(jìn)展[J];山西體育科技;2005年03期

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本文編號(hào)：887947