本文關(guān)鍵詞：酶法合成甘露糖-6-磷酸

  更多相關(guān)文章： 甘露糖-6-磷酸 多聚磷酸鹽 依賴多聚磷酸鹽型甘露糖激酶 大腸桿菌

【摘要】：甘露糖-6-磷酸(Mannose-6-phosphate, M6P)是人體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾的重要磷酸化合物,在醫(yī)療領(lǐng)域以及化妝品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。酶催化相比于化學(xué)法具有專一性強(qiáng)和安全環(huán)保等優(yōu)勢,但催化反應(yīng)所需ATP以及激酶使得生產(chǎn)成本較高。本論文主要目的是開發(fā)一種酶催化合成甘露糖-6-磷酸的新方法,在大腸桿菌中異源表達(dá)一種依賴多聚磷酸鹽型甘露糖激酶,該酶能夠利用多聚磷酸鹽代替價格昂貴的ATP催化合成甘露糖-6-磷酸。論文的研究內(nèi)容包括基因工程菌構(gòu)建、酶學(xué)基本性質(zhì)研究、蛋白表達(dá)條件優(yōu)化、反應(yīng)條件優(yōu)化幾個方面,具體工作與研究結(jié)果如下：(1)克隆了來自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.KM)和分枝桿菌(Mycobacterium sp.MCS)的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶基因,并構(gòu)建了基因工程菌E.coli BL21(DE3) (pET28a-l7/pET28a-mp),提取胞內(nèi)酶以多聚磷酸鹽為磷酸供體進(jìn)行甘露糖-6-磷酸的合成。(2)對分枝桿菌(Mycobacterium sp.MCS)中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶MP的酶學(xué)基本性質(zhì)進(jìn)行研究,MP最適溫度25℃,最適pH為8.5,最適磷酸供體為六偏磷酸鈉,輔因子Mg2+的最適添加濃度為5 mM,MP對葡萄糖以及甘露糖的Km值分別為9.57 mM、203.65mM,對ATP以及六偏磷酸鈉的Km值為4.62 mM、1.7 mM。(3)對節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.KM)中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶L7蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用TB培養(yǎng)基,28 ℃,0.2 mM IPTG誘導(dǎo)12小時后可使蛋白表達(dá)量提高3倍,單位體積發(fā)酵液產(chǎn)酶活量提高4.7倍,高密度發(fā)酵中3 L發(fā)酵產(chǎn)酶共2.25×106U。(4)對節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.KM)中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶L7的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)甘露糖與六偏磷酸鈉摩爾比為1：3,酶液濃度0.356 mg·mL-1,30 ℃, pH 8.5的條件下反應(yīng)3 h后,甘露糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.8%,甘露糖-6-磷酸含量為14 g·L-1。(5)在500 mL甘露糖-6-磷酸合成體系中,當(dāng)?shù)孜锔事短堑臐舛葹?0 g·L1,酶量添加量39.3 U·g-1糖,30 ℃, pH8.5,400 rpm反應(yīng)8小時后,甘露糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)75%,甘露糖-6-磷酸含量為47 g·L-1。
【關(guān)鍵詞】：甘露糖-6-磷酸 多聚磷酸鹽 依賴多聚磷酸鹽型甘露糖激酶 大腸桿菌
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ925;O621.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-20
• 第一章 緒論20-30
• 1.1 引言20
• 1.2 甘露糖-6-磷酸概述20-24
• 1.2.1 甘露糖-6-磷酸簡介20-21
• 1.2.2 甘露糖-6-磷酸的作用以及應(yīng)用前景21-22
• 1.2.3 甘露糖-6-磷酸合成方法22-24
• 1.3 多聚磷酸鹽依賴型激酶概述24-25
• 1.3.1 多聚磷酸鹽簡介24
• 1.3.2 多聚磷酸鹽依賴型激酶簡介24-25
• 1.4 檢測方法25-27
• 1.4.1 甘露糖-6-磷酸檢測方法25-26
• 1.4.2 多聚磷酸鹽檢測方法26-27
• 1.5 糖類磷酸化合物的分離27-28
• 1.6 本論文的研究思路和內(nèi)容28-30
• 第二章 基因工程菌的構(gòu)建30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 實驗材料30-31
• 2.2.1 菌株質(zhì)粒和引物30
• 2.2.2 培養(yǎng)基30-31
• 2.2.3 試劑和儀器31
• 2.3 實驗方法31-36
• 2.3.1 基因的克隆與重組載體構(gòu)建31-33
• 2.3.2 基因誘導(dǎo)表達(dá)33
• 2.3.3 粗酶制備33
• 2.3.4 SDS-PAGE蛋白電泳33-34
• 2.3.5 酶催化驗證34
• 2.3.6 M6P檢測34-36
• 2.4 實驗結(jié)果及分析36-43
• 2.4.1 l7基因表達(dá)載體構(gòu)建36
• 2.4.2 mp基因表達(dá)載體構(gòu)建36
• 2.4.3 l7基因表達(dá)蛋白電泳驗證36-37
• 2.4.4 mp基因表達(dá)蛋白電泳驗證37-38
• 2.4.5 L7酶催化驗證38-42
• 2.4.6 MP酶催化驗證42-43
• 2.5 本章小結(jié)43-44
• 第三章 酶學(xué)基本性質(zhì)研究44-56
• 3.1 引言44
• 3.2 實驗材料44
• 3.2.1 試劑44
• 3.2.2 儀器44
• 3.3 實驗方法44-47
• 3.3.1 酶的純化44-45
• 3.3.2 酶活測定45-46
• 3.3.3 最適溫度46
• 3.3.4 最適pH46
• 3.3.5 最適多聚磷酸鹽供體46
• 3.3.6 二價金屬離子對酶活的影響46-47
• 3.3.7 基本動力學(xué)參數(shù)47
• 3.3.8 最適底物摩爾比47
• 3.3.9 MP合成甘露糖-6-磷酸47
• 3.4 實驗結(jié)果及分析47-54
• 3.4.1 最適溫度47-48
• 3.4.2 最適pH48-49
• 3.4.3 最適多聚磷酸鹽供體49
• 3.4.4 二價金屬離子對酶活的影響49-50
• 3.4.5 基本動力學(xué)參數(shù)50-52
• 3.4.6 最適底物摩爾比52-53
• 3.4.7 MP合成甘露糖-6-磷酸53-54
• 3.5 本章小結(jié)54-56
• 第四章 蛋白表達(dá)條件優(yōu)化56-70
• 4.1 引言56
• 4.2 實驗材料56-57
• 4.2.1 試劑和儀器56
• 4.2.2 培養(yǎng)基56-57
• 4.3 實驗方法57-59
• 4.3.1 L7與MP對比57
• 4.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化57
• 4.3.3 誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)劑添加濃度優(yōu)化57-58
• 4.3.4 誘導(dǎo)方式與誘導(dǎo)時間優(yōu)化58
• 4.3.5 溶氧對蛋白表達(dá)的影響58
• 4.3.6 高密度發(fā)酵58-59
• 4.4 實驗結(jié)果及分析59-69
• 4.4.1 L7與MP對比59
• 4.4.2 培養(yǎng)基優(yōu)化59-61
• 4.4.3 誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)劑添加濃度優(yōu)化61-65
• 4.4.4 誘導(dǎo)方式與誘導(dǎo)時間優(yōu)化65-66
• 4.4.5 溶氧對蛋白表達(dá)的影響66-67
• 4.4.6 高密度發(fā)酵67-69
• 4.5 本章小結(jié)69-70
• 第五章 甘露糖-6-磷酸的合成70-82
• 5.1 引言70
• 5.2 實驗材料70
• 5.2.1 實驗試劑70
• 5.2.2 實驗儀器70
• 5.3 實驗方法70-73
• 5.3.1 甘露糖檢測方法70
• 5.3.2 反應(yīng)時間優(yōu)化70-71
• 5.3.3 反應(yīng)溫度優(yōu)化71
• 5.3.4 反應(yīng)pH優(yōu)化71
• 5.3.5 底物摩爾比優(yōu)化71
• 5.3.6 最適緩沖溶液71-72
• 5.3.7 酶量的優(yōu)化72
• 5.3.8 甘露糖-6-磷酸合成72
• 5.3.9 反應(yīng)pH調(diào)控方式探索72-73
• 5.4 實驗結(jié)果及分析73-80
• 5.4.1 反應(yīng)時間優(yōu)化73-74
• 5.4.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化74
• 5.4.3 反應(yīng)pH優(yōu)化74-75
• 5.4.4 底物摩爾比優(yōu)化75-76
• 5.4.5 最適緩沖溶液76
• 5.4.6 酶量優(yōu)化76-78
• 5.4.7 甘露糖-6-磷酸合成78-79
• 5.4.8 反應(yīng)pH調(diào)控方式探索79-80
• 5.5 本章小結(jié)80-82
• 第六章 結(jié)論及創(chuàng)新點82-84
• 6.1 本文主要結(jié)論82-83
• 6.2 創(chuàng)新點83-84
• 附錄84-88
• 參考文獻(xiàn)88-92
• 致謝92-94
• 研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文94-96
• 作者及導(dǎo)師簡介96-97
• 附件97-98

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳笑梅;池浩超;黃超群;朱巖;朱曉雨;王雪;;沸水阻斷多聚磷酸鹽分解離子色譜法檢測水產(chǎn)品中的多聚磷酸鹽[J];分析化學(xué);2008年10期

2 王揚;何輝;葉磊海;何豐;鄭重鶯;;在線滲析-離子色譜法測定水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的研究[J];南方水產(chǎn)科學(xué);2011年06期

3 楊賢慶;李來好;戚勃;陳勝軍;;多聚磷酸鹽在羅非魚片中擴(kuò)散規(guī)律的研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2007年07期

4 袁麗;高瑞昌;韓國良;喬榮梅;劉麗萍;;肌肉中多聚磷酸鹽水解的研究進(jìn)展[J];農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè));2008年03期

5 王雪;陳笑梅;朱巖;;離子色譜法測定冷凍水產(chǎn)品中的多聚磷酸鹽[J];分析試驗室;2008年07期

6 馮慧;薛長湖;高瑞昌;任兵興;劉鑫;曹榮;尹利昂;;多聚磷酸鹽在冷凍羅非魚肉中的降解及其對魚肉品質(zhì)的影響[J];食品工業(yè)科技;2008年09期

7 崔晗;陳溪;黃大亮;崔妍;曹文軍;楊薈;沈葆真;;離子色譜法同時測定水產(chǎn)品中的檸檬酸鹽和多聚磷酸鹽[J];分析試驗室;2009年S1期

8 靳紅果;彭增起;;肉中添加多聚磷酸鹽的研究進(jìn)展[J];肉類研究;2009年01期

9 韋小燁;林文業(yè);鄧衛(wèi)利;黃文琦;黃一帆;;離子色譜法測定水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的含量[J];廣西科學(xué)院學(xué)報;2010年03期

10 孫亮;肖海龍;王紅青;陳美春;;微波加熱阻斷分解后測定凍水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽-離子色譜法[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2010年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 張麗;王麗;勵建榮;;免試劑離子色譜法檢測水產(chǎn)品及其制品中的多聚磷酸鹽[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第七屆年會論文摘要集[C];2010年

2 高瑞昌;袁麗;;肌肉中多聚磷酸鹽水解的研究進(jìn)展[A];2007中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會學(xué)術(shù)年會暨中國中部地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)學(xué)研研討會論文集[C];2007年

3 閆軍;高峰;張銳;王碗;劉肖;;海產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的離子色譜法測定[A];國產(chǎn)科學(xué)儀器應(yīng)用、創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化學(xué)術(shù)研討會論文集（一）[C];2007年

4 馮慧;薛長湖;高瑞昌;任兵興;劉鑫;曹榮;尹利昂;;多聚磷酸鹽在冷凍羅非魚肉中的降解及其對魚肉品質(zhì)的影響[A];2007年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

5 石廷玉;胡曉敏;鄭大勝;袁志明;;多聚磷酸鹽對球形芽胞桿菌生理功能的調(diào)節(jié)[A];2012年鄂粵微生物學(xué)學(xué)術(shù)年會——湖北省暨武漢微生物學(xué)會成立六十年慶祝大會論文集[C];2012年

6 苗瑞婧;高平;張旭;;利用磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣支架與多聚磷酸鹽對深齲仿生再礦化的研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三十四屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 高瑞昌;鳙魚中多聚磷酸鹽水解機(jī)理及無磷保水劑的研究[D];中國海洋大學(xué);2007年

2 靳紅果;豬肉多聚磷酸酶調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)凝膠特性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 周吉峙;多元LDH層狀雙氫氧化物捕集多聚磷酸鹽的機(jī)制和協(xié)同效應(yīng)[D];上海大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 岳維彥;稀土多聚磷酸鹽納米晶的制備及光學(xué)性能研究[D];南京郵電大學(xué);2015年

2 龔靖;施氏假單胞菌TS44多聚磷酸鹽外切酶(PPX)的銻抗性功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 方位;強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中胞外多聚磷酸鹽特性的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2016年

4 喻小春;酶法合成甘露糖-6-磷酸[D];北京化工大學(xué);2016年

5 馮慧;多聚磷酸鹽在冷凍羅非魚肉中的水解以及水產(chǎn)品無磷保水劑的研究[D];中國海洋大學(xué);2008年

6 許雯雯;多聚磷酸鹽對養(yǎng)殖鱸魚品質(zhì)影響的初步研究[D];浙江工商大學(xué);2011年

7 王瑩瑩;水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的含量測定及風(fēng)險評估[D];青島大學(xué);2012年

8 張麗;水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽離子色譜檢測方法的建立及無磷保水劑的初步研究[D];浙江工商大學(xué);2011年

9 田銳花;多聚磷酸鹽對牛肉加工特性的影響研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 高瑞昌;多聚磷酸鹽在肌肉中水解及其對保水性影響的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

，

本文編號：872996