本文關(guān)鍵詞：聚多巴胺包裹的磁性納米粒子固定化脂肪酶及其催化二氫楊梅素�；难芯�

  更多相關(guān)文章： 黑曲霉脂肪酶 磁性四氧化三鐵納米粒子 聚多巴胺 固定化 二氫楊梅素 �；�

【摘要】：二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)是一種黃酮類化合物。它具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎等多種功效,且是保肝護(hù)肝、解酒醒酒的良品。但是,二氫楊梅素的脂溶性較差,不易被人體的肝臟有效吸收,將其�；啥䴕錀蠲匪仵�,可提高它被肝臟的利用效率。酶促二氫楊梅素�；蚱涓咝�、綠色、反應(yīng)條件溫和、區(qū)域選擇性高等優(yōu)點(diǎn)而已引起人們的廣泛關(guān)注。本文通過篩選得到一種脂肪酶(黑曲霉脂肪酶,Aspergillus niger lipase,ANL),其能有效地催化二氫楊梅素�；�,但是游離脂肪酶容易失活、難以重復(fù)回收利用的特點(diǎn)限制了其進(jìn)一步在工業(yè)上的應(yīng)用。因此,對ANL進(jìn)行固定化能夠很好地解決以上問題,產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。近年來,磁性四氧化三鐵納米粒子(MNPs)由于其超順磁性、比表面積高、生物相容性好、低毒性等性質(zhì)引起了研究人員廣泛關(guān)注,然而,磁性四氧化三鐵納米粒子需要被表面修飾才能進(jìn)一步被用作酶固定化的載體。受海洋生物貽貝粘附作用啟發(fā)而制備的仿生材料聚多巴胺(polydopamine,PDA)制備過程簡單溫和,且聚多巴胺的表面含有酚羥基等具有高反應(yīng)活性的基團(tuán)可以進(jìn)行二次反應(yīng),PDA越來越多地被應(yīng)用在有機(jī)和無機(jī)材料表面的修飾中。本論文采用堿共沉淀法合成了MNPs,并利用多巴胺單體在類似海水的堿性(pH=8.5)條件下的自聚合作用在MNPs表面形成一層聚多巴胺層,從而得到聚多巴胺包裹的磁性四氧化三鐵納米粒子(PD-MNPs),通過對PD-MNPs進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果表明MNPs的尺寸在10 nm左右,表面PDA層的厚度在4 nm左右,PD-MNPs具有良好的耐熱性和超順磁性,晶型仍然和MNPs一樣。然后,以制備的PD-MNPs作為ANL的酶載體,利用聚多巴胺表層中的活性基團(tuán)與含有氨基和巰基的ANL分子發(fā)生邁克爾加成或者席夫堿反應(yīng),將ANL固定在PD-MNPs表面,制備得到一種帶有磁性的、高活性的、高穩(wěn)定性的新型納米級酶制劑ANL@PD-MNPs。并且探討了不同pH、固定化時(shí)間對ANL@PD-MNPs酶活回收率的影響,結(jié)果表明在載體/酶質(zhì)量比為4.8:1,固定化pH為8.0,固定化時(shí)間為12 h的條件下,酶的負(fù)載量為138 mg/g時(shí),酶活回收率達(dá)到83.6%。系統(tǒng)研究了新型納米級酶制劑ANL@PD-MNPs的酶學(xué)性質(zhì),并利用傅立葉紅外光譜儀(FTIR)對游離ANL和ANL@PD-MNPs進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)分析。通過二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),固定化酶ANL@PD-MNPs二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊含量相比于游離anl分別增加了2.74%、0.84%,結(jié)果表明anl經(jīng)過固定化后,其結(jié)構(gòu)剛性和穩(wěn)定性均有所增強(qiáng);固定化酶anl@pd-mnps最適ph為8.0,最適溫度為40°c,同時(shí),anl@pd-mnps酶活性構(gòu)象結(jié)構(gòu)的剛性得到增強(qiáng),其耐受性(熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性、溶劑穩(wěn)定性)均要優(yōu)于游離anl;此外,固定化酶anl@pd-mnps在4°c條件下儲藏20d后,仍有92.8%的相對酶活回收率,遠(yuǎn)高于游離anl。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明,游離anl的vmax/km值為4.07?10-4min-1,而anl@pd-mnps相應(yīng)的vmax/km值為3.73?10-4min-1,anl@pd-mnps的底物親和能力變強(qiáng),酶活性中心更易與底物發(fā)生接觸,在同等條件下其具有更強(qiáng)的催化能力。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,anl固定在pd-mnps后,其穩(wěn)定性和催化活性均有所提高。研究了有機(jī)溶劑中anl@pd-mnps催化dmy�；姆磻�(yīng)。在所選擇的�；w中,僅有乙酸乙烯酯在anl@pd-mnps催化作用下與dmy發(fā)生�；磻�(yīng),所得產(chǎn)物經(jīng)過ms和nmr鑒定為二氫楊梅素-16-乙酸酯。固定化酶anl@pd-mnps催化該dmy乙�；磻�(yīng)的最適底物摩爾比為(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最適溫度為40°c,最適酶添加量為60u。在上述最適條件下,反應(yīng)初速度和轉(zhuǎn)化率分別為7.1mm/h、83.1%。在重復(fù)利用10次后,anl@pd-mnps相對活性仍超過55%,并且其區(qū)域選擇性未受到影響。為了進(jìn)一步提高固定化酶anl@pd-mnps催化dmy酰化反應(yīng)效率,采用含深度共熔溶劑(des)的混合體系作為該反應(yīng)介質(zhì)。結(jié)果表明,在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶劑中,anl@pd-mnps能夠高效催化dmy與乙酸乙烯酯發(fā)生乙�；磻�(yīng),生成二氫楊梅素-16-乙酸酯。該反應(yīng)的最適底物摩爾比為(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最適溫度為45°c,最適酶添加量為50u。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)300mm時(shí),該反應(yīng)在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶劑中反應(yīng)初速度為55.2mm/h,反應(yīng)24h后,轉(zhuǎn)化率為85.3%;而在dmso中,反應(yīng)初速度為34.9mm/h,反應(yīng)48h后,轉(zhuǎn)化率為78.8%�？梢�,在含des的混合溶劑中anl@pd-mnps催化dmy酰化反應(yīng)效率明顯提高了。dmy經(jīng)過�；�,其脂溶性增加,達(dá)到了0.635gdmy-16-乙酸酯/100g油,比dmy的溶解度幾乎增加了10倍。此外,分離純化dmy乙�；a(chǎn)物,并對其抗氧化性進(jìn)行了初步評價(jià)。二氫楊梅素-16-乙酸酯清除dpph自由基的ic50為4.16mg/ml、清除羥基自由基的ic50為1.79mg/ml、螯合fe2+的ic50為0.13mg/ml,表明二氫楊梅素-16-乙酸酯具有良好的抗氧化性。本論文首次研究了聚多巴胺包裹的磁性四氧化三鐵納米材料固定化黑曲霉及其高效催化二氫楊梅素酰化反應(yīng)的研究。該新型納米級酶制劑制備過程簡單,能在磁場作用下實(shí)現(xiàn)酶與反應(yīng)介質(zhì)的迅速分離,具有酶載量高、酶活高、穩(wěn)定性高的特點(diǎn),并且能夠有效催化二氫楊梅素�；�。該研究有助于豐富酶的國定化技術(shù),深化對酶-載體相互作用的認(rèn)識,所建立的生物催化體系可用于其它黃酮類物質(zhì)的生物改性。
【關(guān)鍵詞】：黑曲霉脂肪酶 磁性四氧化三鐵納米粒子 聚多巴胺 固定化 二氫楊梅素 �；�
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q814.2;O621.251
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 緒論16-29
• 1.1 脂肪酶16-18
• 1.1.1 脂肪酶的來源16
• 1.1.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理16-17
• 1.1.3 脂肪酶催化的反應(yīng)及應(yīng)用17-18
• 1.2 酶的固定化18-20
• 1.2.1 酶固定化的意義18-19
• 1.2.2 酶的固定化方法19-20
• 1.3 磁性納米粒子20-22
• 1.3.1 磁性納米粒子的制備20-21
• 1.3.2 MNPs作為酶載體的應(yīng)用21-22
• 1.4 多巴胺修飾化學(xué)22-23
• 1.4.1 仿生粘附材料的起源和發(fā)展22
• 1.4.2 多巴胺仿生修飾的酶載體材料22-23
• 1.5 二氫楊梅素23-26
• 1.5.1 DMY的作用與功效23-25
• 1.5.2 DMY應(yīng)用的局限性及改性研究現(xiàn)狀25-26
• 1.6 含深度共熔溶劑體系中的生物催化26-27
• 1.7 本課題的主要研究內(nèi)容與意義27-29
• 1.7.1 主要研究內(nèi)容27
• 1.7.2 研究意義27-29
• 第二章 PDA包裹的MNPs的制備及表征29-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 2.2 主要儀器設(shè)備29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 2.3.1 MNPs的制備29-30
• 2.3.2 PD-MNPs的制備30
• 2.3.3 PD-MNPs的表征30-31
• 2.4 結(jié)果與討論31-36
• 2.4.1 MNPs和PD-MNPs的形貌、尺寸分析31-32
• 2.4.2 MNPs和PD-MNPs的XPS分析32-33
• 2.4.3 MNPs和PD-MNPs的紅外光譜 (FTIR) 分析33-34
• 2.4.4 MNPs和PD-MNPs的X射線衍射 (XRD) 分析34-35
• 2.4.5 MNPs和PD-MNPs的熱重分析 (TGA)35
• 2.4.6 MNPs和PD-MNPs的震動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì) (VSM)分析35-36
• 2.5 本章小結(jié)36-37
• 第三章 PD-MNPs固定化ANL的研究37-52
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37
• 3.2 主要儀器設(shè)備37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-40
• 3.3.1 ANL粗酶蛋白含量的測定37
• 3.3.2 ANL@PD-MNPs的制備37
• 3.3.4 脂肪酶酶活力和固定化酶蛋白負(fù)載量的測定方法37-38
• 3.3.5 固定化過程中各因素對酶固定化效果的影響38-39
• 3.3.6 ANL@PD-MNPs 的結(jié)構(gòu)表征39
• 3.3.7 ANL@PD-MNPs的酶學(xué)性質(zhì)的表征39-40
• 3.4 結(jié)果與討論40-51
• 3.4.1 PD-MNPs/ANL質(zhì)量比的確定40-41
• 3.4.2 ANL@ PD-MNPs制備過程中pH的確定41-42
• 3.4.3 ANL@ PD-MNPs制備過程中固定化時(shí)間的確定42-43
• 3.4.4 ANL@ PD-MNPs的形貌、尺寸43-44
• 3.4.5 ANL@ PD-MNPs傅里葉紅外光譜分析蛋白二級結(jié)構(gòu)44-45
• 3.4.6 ANL@PD-MNPs最適pH的研究45-46
• 3.4.7 ANL@PD-MNPs最適溫度的研究46-47
• 3.4.8 游離ANL和ANL@PD-MNPs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)47-48
• 3.4.9 ANL@PD-MNPs的pH穩(wěn)定性48
• 3.4.10 ANL@PD-MNPs的熱穩(wěn)定性48-49
• 3.4.11 ANL@PD-MNPs的溶劑耐受性49-50
• 3.4.12 ANL@PD-MNPs的儲藏穩(wěn)定性50-51
• 3.5 本章小結(jié)51-52
• 第四章 ANL@PD-MNPs催化DMY�；磻�(yīng)的研究52-67
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料52
• 4.2 主要儀器設(shè)備52
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法52-57
• 4.3.1 PD-MNPs載體材料的制備52
• 4.3.2 固定化酶ANL@PD-MNPs的制備52
• 4.3.3 固定化酶ANL@PD-MNPs中的酶負(fù)載量以及酶活的測定方法52
• 4.3.4 固定化酶ANL@PD-MNPs催化二氫楊梅素�；磻�(yīng)的一般過程52-53
• 4.3.5 高效液相色譜（HPLC）分析53
• 4.3.6 反應(yīng)初速度、底物轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物選擇性的確定53
• 4.3.7 �；w對ANL@PD-MNPs催化DMY�；磻�(yīng)的影響53-54
• 4.3.8 反應(yīng)溶劑對ANL@PD-MNPs催化DMY應(yīng)的影響54
• 4.3.9 底物摩爾比對ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反應(yīng)的影響54
• 4.3.10 溫度對ANL@PD-MNPs催化DMY�；磻�(yīng)的影響54-55
• 4.3.11 ANL@PD-MNPs量對其催化DMY�；磻�(yīng)的影響55
• 4.3.12 ANL@PD-MNPs操作穩(wěn)定性的研究55
• 4.3.13 DMY乙酰化產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用分析55
• 4.3.14 DMY乙�；a(chǎn)物的分離純化55-56
• 4.3.15 DMY乙�；a(chǎn)物的核磁共振分析56-57
• 4.4 結(jié)果與討論57-65
• 4.4.1 酰基供體對ANL@PD-MNPs催化DMY�；磻�(yīng)的影響57
• 4.4.2 DMY乙酰化產(chǎn)物的HPLC-MS分析57-60
• 4.4.3 DMY乙�；a(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定60-61
• 4.4.4 反應(yīng)溶劑對ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；磻�(yīng)的影響61-62
• 4.4.5 底物摩爾比對ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；磻�(yīng)的影響62-63
• 4.4.6 溫度對ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反應(yīng)的影響63-64
• 4.4.7 ANL@PD-MNPs加入量對其催化DMY乙�；磻�(yīng)的影響64-65
• 4.4.8 ANL@PD-MNPs的操作穩(wěn)定性研究65
• 4.5 本章小結(jié)65-67
• 第五章 含DES體系中ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；磻�(yīng)的研究67-78
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料67
• 5.2 主要儀器設(shè)備67
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法67-70
• 5.3.1 ANL@PD-MNPs的制備67
• 5.3.2 ANL@PD-MNPs中的酶負(fù)載量以及酶活的測定方法67
• 5.3.3 DESs的合成67
• 5.3.4 在DESs或者混合溶劑體系中ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反應(yīng)的一般過程67
• 5.3.5 在不同的DESs中ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；难芯�67-68
• 5.3.6 不同比例混合溶劑對ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；磻�(yīng)的研究68
• 5.3.7 底物摩爾比對ANL@PD-MNPs在ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中催化DMY乙酰化反應(yīng)的影響68
• 5.3.8 酶量對ANL@PD-MNPs在ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中催化DMY乙�；磻�(yīng)的影響68-69
• 5.3.9 ANL@PD-MNPs在反應(yīng)介質(zhì)ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中操作穩(wěn)定性的研究69
• 5.3.10 DMY及DMY16乙酸酯脂溶性的測定69
• 5.3.11 DMY及DMY16乙酸酯的抗氧化性能力的研究69-70
• 5.4 結(jié)果與討論70-77
• 5.4.1 在不同DESs反應(yīng)介質(zhì)中ANL@PD-MNPs催化DMY乙�；挠绊�70-71
• 5.4.2 不同比例混合溶劑對ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反應(yīng)的影響71-72
• 5.4.3 底物摩爾比對ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反應(yīng)的影響72-73
• 5.4.4 ANL@PD-MNPs酶量對其催化DMY乙�；磻�(yīng)的影響73
• 5.4.5 ANL@PD-MNPs在反應(yīng)介質(zhì)ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中操作穩(wěn)定性的研究73-74
• 5.4.6 DMY和DMY16乙酸酯脂溶性的測定74
• 5.4.7 DMY和DMY16乙酸酯清除DPPH自由基能力的測定74-75
• 5.4.8 DMY和DMY16乙酸酯羥基自由基清除能力的測定75-76
• 5.4.9 DMY和DMY16乙酸酯螯合Fe2+能力的測定76-77
• 5.5 本章小結(jié)77-78
• 結(jié)論與展望78-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 附錄 校正曲線88-89
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果89-90
• 致謝90-91
• 附件91

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張友勝,楊偉麗,胡自勇;“增溫溶解,保溫過柱,溫水解吸”提制二氫楊梅素(二)[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2002年04期

2 張志堅(jiān);張曉元;李國林;印大中;郭勇;;二氫楊梅素對細(xì)胞等氧化傷害時(shí)的保護(hù)作用[J];湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

3 鄭秋，

本文編號：854928