本文關(guān)鍵詞：17β-雌二醇分子印跡仿生免疫快速檢測方法研究

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【摘要】：目前食品安全問題已逐漸成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn),其中農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、毒素等有毒有害物質(zhì)的檢測方法研究是對食品安全進(jìn)行監(jiān)督管理的技術(shù)保障。動(dòng)物飼養(yǎng)過程中,雌激素類物質(zhì)經(jīng)常被添加入飼料中,用于提高動(dòng)物性產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量,縮短動(dòng)物的生長周期,提高生產(chǎn)效率。17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)作為環(huán)境雌激素中活性最強(qiáng)的物質(zhì)之一,普遍存在于環(huán)境和動(dòng)物源性食品中,若長期通過食物鏈在人體中富集,會(huì)對人體造成嚴(yán)重危害。目前對雌激素的檢測主要采用儀器分析方法和免疫學(xué)方法。儀器分析方法需要借助大型的儀器設(shè)備,樣品前處理過程復(fù)雜;免疫學(xué)方法需要借助抗體,但抗體的制備和篩選尤為復(fù)雜,且易失活。因此建立一種既能實(shí)現(xiàn)快速檢測,方法簡便,又無需借助抗體的檢測方法十分重要。分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymer,MIP)具有可以特異性識(shí)別待測物質(zhì)的位點(diǎn),可與待測物質(zhì)特異性結(jié)合,類似于抗原抗體識(shí)別反應(yīng),稱為仿生免疫。并且MIP具有耐高溫、耐強(qiáng)酸堿環(huán)境、可長期保存等優(yōu)點(diǎn)。論文針對17β-E2分子印跡仿生免疫快速檢測建立了兩種新方法:基于試紙條的分子印跡仿生酶聯(lián)免疫快速檢測方法,以及基于酶標(biāo)板的分子印跡仿生免疫快速檢測方法。這兩種方法均可實(shí)現(xiàn)對17β-E2的快速檢測,與傳統(tǒng)方法相比較具有簡單快速、價(jià)格低廉、容易操作等優(yōu)點(diǎn)。本論文內(nèi)容主要包括以下四個(gè)部分:第一章主要概述了17β-E2檢測方法的研究進(jìn)展,分子印跡技術(shù)的原理、步驟和分類,簡單介紹了各類分子印跡制備方法。重點(diǎn)介紹了基于試紙條、酶標(biāo)板的分子印跡技術(shù)研究進(jìn)展,以及分子印跡技術(shù)在環(huán)境雌激素檢測中應(yīng)用。第二章建立了一種17β-E2分子印跡仿生酶聯(lián)免疫試紙條快速檢測方法。在試紙條表面制備一層分子印跡聚合物薄膜,聚合物上具有可特異性識(shí)別17β-E2的位點(diǎn)。通過17β-E2和酶標(biāo)記17β-E2對結(jié)合位點(diǎn)的競爭結(jié)合作用,加入酶的底物顯色,根據(jù)顏色深淺即可對17β-E2實(shí)現(xiàn)定性以及半定量檢測。本章內(nèi)容主要對試紙條類型的選擇,合成條件的優(yōu)化,靈敏度的提高,實(shí)驗(yàn)方法性能的考察及基質(zhì)影響的消除進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,MIP合成的最佳聚合反應(yīng)條件為:12 mL乙腈作為反應(yīng)溶劑,模板分子17β-E2的添加量為0.1 g,功能單體3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)的添加量為1014μL,交聯(lián)劑四乙氧基硅烷(TEOS)的添加量為963μL,催化劑(0.1 mol·L-1乙酸)的添加量為100μL。在此最佳條件下合成的MIP具有較強(qiáng)的識(shí)別能力,可基本消除非特異性吸附,方法檢測限可達(dá)到0.25μg·L-1。第三章建立了一種17β-E2分子印跡仿生免疫酶標(biāo)板快速檢測方法。在96孔酶標(biāo)板表面合成分子印跡聚合物,通過17β-E2和熒光標(biāo)記的17β-E2對識(shí)別位點(diǎn)的競爭結(jié)合作用,檢測熒光強(qiáng)度,即可對17β-E2實(shí)現(xiàn)定量檢測。本章內(nèi)容主要對合成條件的優(yōu)化,方法性能的考察,及基質(zhì)影響的消除進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,MIP合成的最佳聚合反應(yīng)條件為:10 mL無水乙醇作為反應(yīng)溶劑,模板分子17β-E2的添加量為0.1 g,功能單體APTES的添加量為676μL,交聯(lián)劑TEOS的添加量為642μL,催化劑(0.1 mol·L-1乙酸)的添加量為100μL,在此條件下合成的MIP具有較強(qiáng)的識(shí)別能力,可基本消除非特異性吸附。該方法的檢測限可達(dá)到0.22μg·L-1,靈敏度可達(dá)到1.79μg·L-1。第四章對所建立的17β-E2分子印跡仿生酶聯(lián)免疫試紙條快速檢測方法和酶標(biāo)板快速檢測方法進(jìn)行了總結(jié)。這兩種方法分別以試紙條和96孔酶標(biāo)板為載體成功在其表面合成MIP,并在此基礎(chǔ)上建立了兩種對17β-E2的快速檢測方法。與傳統(tǒng)檢測方法相比較,具有快速、靈敏度高、操作簡單、價(jià)格低廉、無需借助抗體等優(yōu)點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：17β-雌二醇 分子印跡 仿生免疫 試紙條 酶標(biāo)板
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O631.3;O657
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 中英文名詞術(shù)語對照12-13
• 第一章 緒論13-25
• 1 研究背景13-17
• 1.1 17β-雌二醇簡介13-15
• 1.2 17β-E2檢測方法研究進(jìn)展15-17
• 2 分子印跡仿生抗體的制備17-24
• 2.1 分子印跡技術(shù)概述17-18
• 2.2 分子印跡的基本原理和步驟18-19
• 2.3 分子印跡技術(shù)的分類19-21
• 2.4 分子印跡聚合物的制備方法21-22
• 2.5 基于試紙條的分子印跡技術(shù)研究進(jìn)展22-23
• 2.6 基于酶標(biāo)板的分子印跡技術(shù)研究進(jìn)展23
• 2.7 分子印跡技術(shù)在環(huán)境激素檢測中的應(yīng)用23-24
• 3 論文的選題意義及研究內(nèi)容24-25
• 第二章 17β-雌二醇分子印跡仿生酶聯(lián)免疫試紙條快速檢測方法研究25-44
• 1 研究目的與意義25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器26-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑26-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液的配制28-29
• 3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟29-33
• 3.1 酶聯(lián) 17β-雌二醇（17β-E2-HRP）的合成方法29
• 3.2 試紙條上分子印跡聚合物的制備29-31
• 3.3 分子印跡聚合物模板分子的洗脫31
• 3.4 試紙條非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉方法31-32
• 3.5 方法靈敏度的考察方法32
• 3.6 方法選擇性的考察方法32-33
• 3.7 方法重現(xiàn)性的考察方法33
• 3.8 方法穩(wěn)定性的考察方法33
• 3.9 實(shí)際樣品的預(yù)處理方法33
• 4 結(jié)果與討論33-42
• 4.1 試紙條類型的選擇33-34
• 4.2 非特異性吸附的消除34-37
• 4.3 方法靈敏度的提高37-38
• 4.4 方法性能指標(biāo)的考察38-42
• 4.5 實(shí)際樣品基質(zhì)影響的考察42
• 5 本章小結(jié)42-44
• 第三章 17β-雌二醇分子印跡仿生免疫酶標(biāo)板快速檢測方法研究44-60
• 1 研究目的與意義44-45
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器45-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑45-46
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器46
• 2.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液的配制46-47
• 3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟47-51
• 3.1 熒光標(biāo)記 17β-雌二醇（17β-E2-FITC）的制備方法47-48
• 3.217β-E2-FITC的分離純化48
• 3.3 酶標(biāo)板上分子印跡聚合物的制備48-49
• 3.4 分子印跡聚合物模板分子的洗脫49-50
• 3.5 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立50
• 3.6 方法選擇性的考察方法50
• 3.7 實(shí)際樣品的預(yù)處理方法50-51
• 4 結(jié)果與討論51-58
• 4.1 熒光標(biāo)記 17β-E2的制備51
• 4.2 非特異性吸附的消除51-55
• 4.3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立55
• 4.4 方法性能指標(biāo)的考察55-58
• 4.5 實(shí)際樣品基質(zhì)影響的考察58
• 5 本章小結(jié)58-60
• 第四章 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69-70
• 攻讀碩士期間科研成果70

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本文編號：774624