本文關鍵詞：基于綠色溶劑的磁性固相萃取技術在蛋白質分離中的應用研究

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【摘要】：磁性固相萃取技術(Magnetic Solid Phase Extraction, MSPE)是以磁性材料作為吸附劑的一種分散固相萃取技術,該技術的關鍵是設計合成功能化的吸附劑。作為新型綠色溶劑的低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvent, DES)和離子液體(Ionic Liquid, IL)具有結構可設計性和易功能化的優(yōu)點,固定至磁性顆粒上將得到負載型低共熔溶劑或負載型離子液體,將其作為磁性固相萃取技術的吸附劑,可以充分發(fā)揮低共熔溶劑或離子液體和磁性顆粒兩者的優(yōu)勢。因而,與低共熔溶劑或離子液體相結合,磁性固相萃取技術將會得到更為廣闊的應用。本研究設計合成兩類綠色溶劑——低共熔溶劑和離子液體,結合磁性固相萃取技術,建立了萃取分離蛋白質的方法。主要內容如下：(1)氯化膽堿類低共熔溶劑修飾的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白質首先合成四種氯化膽堿類低共熔溶劑(DES),用來修飾磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4@GO)合成Fe_3O_4@GO-DES復合物,再用于蛋白質的磁性固相萃取。用X-射線衍射儀、振動樣品磁強計、傅里葉變換紅外光譜儀、場發(fā)射掃描電子顯微鏡、熱重分析儀對Fe_3O_4@GO-DES進行表征。以牛血清白蛋白(BSA)為研究對象,通過單因素實驗考察了低共熔溶劑的種類、萃取溫度、溶液離子強度、萃取時間、蛋白質濃度和Fe_3O_4@GO-DES加入量對萃取容量的影響。在最佳萃取條件下,萃取容量可達100.2 mg/g。萃取之后,選擇0.005 mol/LNa2HP04-1 mol/LNaCI的水溶液作為洗脫液對含BSA的萃取劑進行洗脫,洗脫率可達90.9%。用圓二色譜儀(CD)測定了洗脫所得BSA的二級結構,結果表明其二級結構沒有發(fā)生改變。另外,實驗還將所提出的Fe_3O_4@GO-DES-MSPE技術應用于卵清蛋白(OVA)、溶菌酶(Lys)和牛血紅蛋白(BHb)的萃取。所擬方法為蛋白質的分離純化提供了一種新思路。(2)甜菜堿類離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取蛋白質采用共沉淀法制備了Fe304,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對Fe_3O_4進行修飾得到Fe_3O_4/APTES顆粒,再通過靜電相互作用使其與GO結合形成磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4/APTES/GO).用所合成的甜菜堿類離子液體修飾Fe_3O_4/APTES/GO顆粒得到Fe_3O_4/APTES/GO/IL,并將其應用于牛血清白蛋白(BSA)的萃取。用振動樣品磁強計、X-射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀、場發(fā)射掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、Zeta電位分析儀對Fe_3O_4/APTES/GO/IL進行表征。通過單因素實驗考察了離子液體種類、萃取溫度、萃取時間、BSA濃度、溶液離子強度和溶液pH值對萃取容量的影響。在最佳萃取條件下,萃取容量可達139.1 mg/g。對比實驗表明,Fe_3O_4/APTES/GO/IL對BSA的萃取能力明顯大于裸露Fe304納米顆粒以及Fe_3O_4/APTES/GO 對 BSA的萃取能力。以0.8 mol/L K2HPO4-1 mol/L NaCl的水溶液作為洗脫液對含有BSA的萃取劑進行洗脫,洗脫率可達95.5%。圓二色譜儀測定結果表明洗脫所得BSA的二級結構沒有發(fā)生變化。實驗還將小牛全血作為實際樣品,考察了Fe_3O_4/APTES/GO/IL在實際應用中的萃取性能,結果令人滿意。(3)聚合離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取胰蛋白酶以一種陰離子含有不飽和鍵的離子液體為單體,通過共價鍵合的方法在3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修飾的磁性Fe304顆粒(Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS)表面接枝離子液體聚合物(PIL),得到負載型聚合離子液體(Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL)。用振動樣品磁強計、X-射線衍射儀、場發(fā)射掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀、Zeta電位分析儀對Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL進行表征。以Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL為磁性固相萃取劑,胰蛋白酶(Try)為研究對象,進行了一系列的單因素萃取研究。在最佳萃取條件下,萃取容量可達182.7 mg/g。實驗還比較了Fe_3O_4/SiO2、Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS和Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL對Try的萃取能力。對含有Try的磁性固相萃取劑進行洗脫,并測定了超純水中和洗脫液中Try的活性,它們的比活性Ur分別為1.0和0.83,這一實驗結果表明,從磁性固相萃取劑上洗脫下來的Try的活性雖然低于其在超純水中的活性,但是仍具有一定的活性。所擬方法為其他生物活性物質的萃取分離提供了一種思路。
【關鍵詞】：磁性固相萃取技術 低共熔溶劑 離子液體 聚合離子液體 蛋白質
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O658.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-27
• 1.1 蛋白質純化13-16
• 1.1.1 蛋白質純化的意義13
• 1.1.2 純化蛋白質常用的方法13-16
• 1.1.3 問題與展望16
• 1.2 磁性固相萃取技術16-18
• 1.2.1 磁性固相萃取技術簡介16-17
• 1.2.2 磁性顆粒的表面修飾17
• 1.2.3 問題與展望17-18
• 1.3 低共熔溶劑18-21
• 1.3.1 低共熔溶劑的組成18
• 1.3.2 低共熔溶劑的合成18-19
• 1.3.3 低共熔溶劑的性質19-20
• 1.3.4 低共熔溶劑的應用20-21
• 1.3.5 問題與展望21
• 1.4 離子液體21-25
• 1.4.1 離子液體的發(fā)展歷史21-22
• 1.4.2 離子液體的組成22
• 1.4.3 離子液體的合成22-23
• 1.4.4 離子液體的特點23-24
• 1.4.5 離子液體的應用24
• 1.4.6 問題與展望24-25
• 1.5 聚合離子液體25
• 1.5.1 聚合離子液體概述25
• 1.5.2 問題與展望25
• 1.6 本課題的研究意義與研究內容25-27
• 1.6.1 本課題的研究背景與意義25-26
• 1.6.2 本課題的研究內容26-27
• 第2章 氯化膽堿類低共熔溶劑修飾的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白質27-43
• 2.1 引言27-28
• 2.2 實驗部分28-32
• 2.2.1 試劑與儀器28-29
• 2.2.2 低共熔溶劑修飾的磁性顆粒(Fe_3O_4@GO-DES)的制備29-31
• 2.2.3 磁性固相萃取實驗31-32
• 2.3 結果與討論32-42
• 2.3.1 低共熔溶劑的表征32
• 2.3.2 Fe_3O_4@GO-DES顆粒的表征32-36
• 2.3.3 單因素實驗36-38
• 2.3.4 Fe_3O_4@GO和Fe_3O_4@GO-DES萃取容量的比較38-39
• 2.3.5 洗脫與重復利用實驗39-41
• 2.3.6 方法學考察41-42
• 2.4 小結42-43
• 第3章 甜菜堿類離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取蛋白質43-59
• 3.1 引言43-44
• 3.2 實驗部分44-47
• 3.2.1 試劑與儀器44-45
• 3.2.2 離子液體修飾的磁性顆粒(Fe_3O_4/APTES/GO/IL)的制備45-46
• 3.2.3 Zeta電勢的測量46
• 3.2.4 磁性固相萃取實驗46-47
• 3.2.5 實際樣品的萃取實驗47
• 3.3 結果與討論47-58
• 3.3.1 離子液體的表征47-48
• 3.3.2 Fe_3O_4/APTES/GO/IL顆粒的表征48-53
• 3.3.3 單因素實驗53-55
• 3.3.4 Fe_3O_4、Fe_3O_4/APTES/GO和Fe_3O_4/APTES/GO/IL萃取容量的比較55-56
• 3.3.5 洗脫與重復利用實驗56-57
• 3.3.6 實際樣品的萃取實驗57-58
• 3.3.7 方法學考察58
• 3.4 小結58-59
• 第4章 聚合離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取胰蛋白酶59-71
• 4.1 引言59-60
• 4.2 實驗部分60-63
• 4.2.1 試劑與儀器60-61
• 4.2.2 聚合離子液體修飾的磁性顆粒(Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL)的制備61
• 4.2.3 磁性固相萃取實驗61-62
• 4.2.4 胰蛋白酶的活性測定62-63
• 4.3 結果與討論63-70
• 4.3.1 Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL顆粒的表征63-67
• 4.3.2 萃取對象的選擇67
• 4.3.3 單因素實驗67-68
• 4.3.4 Fe_3O_4/SiO_2、Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS和Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL萃取容量的比較68
• 4.3.5 洗脫與重復利用實驗68-69
• 4.3.6 胰蛋白酶的活性分析69
• 4.3.7 方法學考察69-70
• 4.4 小結70-71
• 結論與展望71-73
• 參考文獻73-86
• 附錄A 攻讀學位期間所發(fā)表的學術論文目錄86-87
• 致謝87

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本文編號：683401