本文關鍵詞：蛋白組學分析沼澤紅假單胞菌富集鈷的機理研究

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【摘要】：過量的鈷對農作物的生長和人體健康有嚴重危害。沼澤紅假單胞菌屬于光合細菌紫色非硫菌群紅假單胞屬,來源豐富,培養(yǎng)成本低,環(huán)境適應性強以及對重金屬具有極強的耐受能力和富集能力。因此,研究該菌對重金屬鈷的富集條件及富集機理具有廣闊的應用前景和重要的意義。本實驗研究沼澤紅假單胞菌對鈷離子富集條件,并采用蛋白組學和熒光定量PCR技術比較該菌株在富集鈷過程中蛋白質的表達變化,以及對某些相關的蛋白質的功能進行分析,初步揭示了沼澤紅假單胞菌富集鈷的機理。本論文主要研究了以下內容。1.研究4種不同代謝條件(厭氧光照、厭氧黑暗、好氧光照和好氧黑暗)對鈷離子富集情況,確定在好氧黑暗條件下沼澤紅假單胞菌對初始濃度為80mg/L鈷離子去除率為89.4%。在此基礎上,優(yōu)化pH和溫度對沼澤紅假單胞菌富集,發(fā)現(xiàn)在pH=6.5,30℃時,對初始濃度為160 mg/L鈷離子去除率達到84.9%,富集容量為287.18 mg/g。在共存離子實驗中,Ni~(2+)會明顯影響鈷離子去除率,使鈷的去除率降至59.67%,而Cu~(2+),Zn~(2+),Cd~(2+),Mn~(2+)和Fe~(2+)對鈷離子的去除率幾乎沒有影響。在優(yōu)化的實驗條件下,沼澤紅假單胞菌對鈷離子的去除符合二級動力學特征(R2=0.9519-0.9931)。2.對沼澤紅假單胞菌進行分區(qū)發(fā)現(xiàn),細胞表面、細胞周質、細胞膜和細胞質對鈷的富集容量分別為4.99,49.82,24.43,7.69 mg/g。其中,鈷主要集中分布在細胞周質和細胞膜上,占菌體富集鈷總量的85.32%。對富集鈷和未富集鈷的菌體進行X-射線衍射,發(fā)現(xiàn)未富集鈷的菌體細胞呈無定型態(tài),而富集鈷后的菌體細胞有明顯的衍射峰,通過與標準八水磷酸鈷(JCPDS#01-0121)的數(shù)據(jù)比較分析,證明菌體富集鈷后形成八水磷酸鈷。3.建立分離沼澤紅假單胞菌蛋白的雙向凝膠技術,獲得了分辨率高、重現(xiàn)性好的蛋白圖譜。通過PDQuest軟件分析對比鈷離子濃度為80 mg/L和空白對照條件下蛋白質電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)有36個蛋白點發(fā)生了顯著差異表達。采用MALDI-TOF-MS-MS質譜儀鑒定出25個蛋白質,其中19個蛋白點表達上調,6個蛋白點表達下調。利用NCBI數(shù)據(jù)庫尋找匹配的蛋白質和GO數(shù)據(jù)庫進行功能注釋分析。按生物功能將25個差異蛋白可分為七類:蛋白質合成;蛋白質降解;應激蛋白;參與碳水化合物代謝;參與氨基酸代謝;轉運蛋白和其他蛋白。這表明沼澤紅假單胞菌富集鈷的過程是一個復雜的網絡調控體系,與菌體內部多個蛋白質表達有關。氨基酸代謝蛋白中甲硫氨酸腺苷基轉移酶(METK)主要對細菌起到解毒作用;轉運蛋白中磷酸酸根轉運蛋白(PSTS)也大量表達,結合X-射線衍射和細胞分區(qū),磷酸酸根轉運蛋白在細胞周質中可能通過調控磷酸根來富集鈷離子。4.提取鈷離子濃度為80 mg/L和空白對照條件下的mRNA,利用逆轉錄技術得到cDNA。以SYBR GreenΙ為指示劑,通過熒光定量PCR對具有解毒功能的METK和調控磷酸根的PSTS基因進行實時監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)在富集鈷過程中,這兩個基因的表達量分別上調了4.03和12.99倍,這與雙向凝膠電泳圖譜上蛋白水平基本保持一致。從轉錄學水平驗證說明METK和PSTS蛋白在沼澤紅假單胞菌富集鈷過程中具有重要意義。
【關鍵詞】：沼澤紅假單胞菌 富集鈷 蛋白組學 差異蛋白 磷酸根轉運蛋白
【學位授予單位】：成都理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O614.812;O657.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 前言10-19
• 1.1 引言10-11
• 1.1.1 重金屬污染10
• 1.1.2 鈷的來源與危害10-11
• 1.2 含鈷廢水主要處理方法11-13
• 1.2.1 化學沉淀法11
• 1.2.2 離子交換法11-12
• 1.2.3 膜分離法12
• 1.2.4 生物法12-13
• 1.3 光合細菌對重金屬離子的富集研究13-15
• 1.3.1 野生光合菌富集重金屬離子研究13-15
• 1.3.2 基因工程光合菌富集重金屬離子研究15
• 1.4 蛋白質組學15-17
• 1.4.1 蛋白質組學研究技術15-16
• 1.4.2 蛋白組學分析微生物與重金屬作用機理16-17
• 1.5 研究目的和意義17-19
• 第2章 沼澤紅假單胞菌富集鈷的研究19-29
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 主要試劑19-20
• 2.1.2 主要儀器20
• 2.1.3 RCVBN培養(yǎng)基20-21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 沼澤紅假單胞菌富集鈷的條件優(yōu)化21-22
• 2.2.2 鈷在沼澤紅假單胞菌中的分布22
• 2.2.3 X-射線衍射22
• 2.3 結果22-28
• 2.3.1 沼澤紅假單胞菌富集鈷的條件優(yōu)化22-25
• 2.3.2 沼澤紅假單胞菌對鈷去除的動力學25-27
• 2.3.3 鈷在沼澤紅假單胞菌中的分布27
• 2.3.4 X-射線衍射分析27-28
• 2.4 討論28-29
• 第3章 蛋白質的分離及質譜鑒定29-45
• 3.1 材料29-31
• 3.1.1 試劑29-30
• 3.1.2 主要儀器30
• 3.1.3 主要溶液配制30-31
• 3.2 方法31-34
• 3.2.1 蛋白質的提取31
• 3.2.2 蛋白質的純化31-32
• 3.2.3 蛋白質的檢測32
• 3.2.4 雙向凝膠電泳32-34
• 3.2.5 蛋白膠內酶解34
• 3.2.6 質譜檢測34
• 3.2.7 數(shù)據(jù)分析34
• 3.3 結果34-41
• 3.3.1 Bradford法測定蛋白質的標準曲線34-35
• 3.3.2 雙向電泳條件優(yōu)化35-36
• 3.3.3 差異蛋白譜圖分析36-37
• 3.3.4 質譜的鑒定分析37-41
• 3.4 討論41-45
• 3.4.1 雙向電泳方法優(yōu)化討論41
• 3.4.2 質譜結果討論41-45
• 第4章 METK和PSTS蛋白基因的轉錄定量分析45-53
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 試劑45
• 4.1.2 儀器與設備45-46
• 4.2 方法46-48
• 4.2.1 沼澤紅假單胞菌總RNA提取46
• 4.2.2 逆轉錄反應46-47
• 4.2.3 實時熒光定量PCR擴增47
• 4.2.4 定量分析方法47-48
• 4.3 結果48-51
• 4.3.1 沼澤紅假單胞菌RNA提取48
• 4.3.2 16S rRNA標準曲線48-49
• 4.3.3 實時熒光定量PCR結果49-50
• 4.3.4 METK和PSTS基因表達差異比較50-51
• 4.4 討論51-53
• 4.4.1 RNA的提取51
• 4.4.2 qRT-PCR方法的選擇51
• 4.4.3 mRNA與蛋白質表達水平之間的分析51-53
• 結論53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻55-61
• 攻讀學位期間取得學術成果61-62
• 附錄62-74

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1 白紅娟;張肇銘;，

本文編號：623831