本文關(guān)鍵詞：綠豆肽的結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性物質(zhì)的影響作用研究

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【摘要】：蛋白質(zhì)水解形成的具有生物活性的肽類(lèi)被證實(shí)是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì),生物活性肽的各種功能活性及作用機(jī)理的研究是開(kāi)發(fā)蛋白肽保健功能食品和藥品的重要理論基礎(chǔ)。本文以Alcalase 2.4L堿性蛋白酶水解得到的綠豆肽(MBPs)為研究對(duì)象,通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等方法,分析其氨基酸組成、分子量分布和結(jié)構(gòu)特點(diǎn),進(jìn)而研究其對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)糖原、核酸、酸性ATP酶(ATPase)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響,并通過(guò)測(cè)定巨噬細(xì)胞NO的分泌量、iNOS活性以及iNOSmRNA表達(dá)量等指標(biāo)討論其對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性的影響。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.MBPs的結(jié)構(gòu)鑒定和分析。水解度為32.25%的MBPs共包含17種氨基酸,包括非極性氨基酸28.37%、極性中性氨基酸15.03%、酸性氨基酸32.27%和堿性氨基酸24.33%,免疫相關(guān)的非極性和堿性氨基酸含量較高;SDS-PAGE和HPLC顯示其分子量在6.5KDa以下的含量豐富。紅外結(jié)果顯示,MBPs可能含多種不飽和基團(tuán),仍含有蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊,而不規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)已被酶解而打開(kāi);質(zhì)譜得到MBPs包含216種肽段主要?dú)w屬于匹配度較高的24種蛋白質(zhì)來(lái)源,肽末端非極性和堿性氨基酸含量較高。2.MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞中活性物質(zhì)的影響。MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,MBPs能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖(P0.05),并能減弱LPS對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的抑制作用;MBPs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞糖原和核酸染色明顯加深,一定程度上反應(yīng)了MBPs培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞活躍度增強(qiáng);MBPs濃度為200μg/mL以上時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)ATPase活性有顯著的促進(jìn)作用(P0.05),MBPs可以顯著緩解LPS對(duì)ATPase活性的抑制;MBPs濃度大于100μg/mL時(shí),對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LZM活性增強(qiáng)作用顯著(P0.05),對(duì)LPS導(dǎo)致的LZM活性減弱有顯著(P0.05)的緩解作用。MBPs濃度在200μg/mL以上才對(duì)巨噬細(xì)胞酶內(nèi)SOD活性和抑制LPS的刺激作用有顯著的效果(P0.05)。3.MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞NO、iNOS及iNOS mRNA的影響。MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間在24h之后顯著(P0.05)增強(qiáng)其N(xiāo)O分泌量。MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞NO分泌有促進(jìn)作用,添加量為10μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞NO分泌量影響不顯著(P0.05),濃度為200μg/mL和400μg/mL兩組之間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異,MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO的促進(jìn)效果較LPS低,并可以顯著降低LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激。MBPs和LPS都能夠顯著(P0.05)提高iNOS的活性,但MBPs又能夠抑制LPS導(dǎo)致的iNOS過(guò)度表達(dá),且MBPs濃度越高作用效果越明顯。iNOSmRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,MBPs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中iNOSmRNA表達(dá)量有所增加,但低于LPS單獨(dú)刺激的作用效果,MBPs也可以減輕LPS引起的巨噬細(xì)胞iNOSmRNA的過(guò)度表達(dá)。MBPs分子量大多集中在6.5KDa以下,結(jié)構(gòu)存在α-螺旋和不規(guī)則卷曲,包含肽段豐富。MBPs能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖提高巨噬細(xì)胞活性,對(duì)巨噬細(xì)胞NO分泌、i NOS活性和iNOSmRNA表達(dá)的也有促進(jìn)作用,說(shuō)明能促使巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。
【關(guān)鍵詞】：綠豆肽 結(jié)構(gòu)分析 巨噬細(xì)胞 一氧化氮 免疫調(diào)節(jié)
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：O629.72;TS201.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 食源性免疫活性肽的研究現(xiàn)狀11-13
• 1.1.1 動(dòng)物源免疫活性肽11-12
• 1.1.2 植物源免疫活性肽12-13
• 1.1.3 免疫活性肽的研究前景13
• 1.2 免疫活性肽的調(diào)節(jié)機(jī)理研究進(jìn)展13-14
• 1.3 免疫活性肽對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用14-16
• 1.4 綠豆蛋白源生物活性肽的研究進(jìn)展16-18
• 1.4.1 ACE抑制活性16-17
• 1.4.2 抗氧化活性17
• 1.4.3 免疫活性17-18
• 1.5 課題的研究背景及意義18-19
• 1.6 課題研究的主要內(nèi)容19-20
• 1.7 技術(shù)路線(xiàn)20-21
• 第二章 MBPs的結(jié)構(gòu)鑒定和分析21-33
• 2.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備21-22
• 2.1.1 試驗(yàn)材料21
• 2.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備21-22
• 2.2 試驗(yàn)方法22-24
• 2.2.1 MBPs的制備工藝22
• 2.2.2 綠豆蛋白氨基酸組成分析22
• 2.2.3 電泳測(cè)定MBPs相對(duì)分子量分布22-23
• 2.2.4 高效液相測(cè)定MBPs相對(duì)分子量分布23
• 2.2.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定MBPs結(jié)構(gòu)23
• 2.2.6 質(zhì)譜測(cè)定MBPs結(jié)構(gòu)23-24
• 2.3 結(jié)果與分析24-30
• 2.3.1 MBPs氨基酸組成分析24-25
• 2.3.2 MBPs相對(duì)分子量分布的測(cè)定25-26
• 2.3.3 MBPs結(jié)構(gòu)的傅里葉紅外光譜測(cè)定26-28
• 2.3.4 MBPs結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜測(cè)定28-30
• 2.4 討論30
• 2.5 小結(jié)30-33
• 第三章 MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞中活性物質(zhì)的影響33-47
• 3.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備33-34
• 3.1.1 試驗(yàn)材料33-34
• 3.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備34
• 3.2 試驗(yàn)方法34-38
• 3.2.1 試驗(yàn)路線(xiàn)34
• 3.2.2 巨噬細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存34-35
• 3.2.3 試驗(yàn)分組與處理35
• 3.2.4 蛋白質(zhì)抽提與定量35-36
• 3.2.5 MTT檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖36
• 3.2.6 巨噬細(xì)胞活性成分的測(cè)定36-37
• 3.2.7 溶菌酶LZM測(cè)定37
• 3.2.8 超氧化物歧化酶SOD活力測(cè)定37-38
• 3.2.9 統(tǒng)計(jì)分析38
• 3.3 結(jié)果與分析38-45
• 3.3.1 MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖38-39
• 3.3.2 MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞糖原和核酸的影響39-42
• 3.3.3 MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞中ATPase的影響42-43
• 3.3.4 MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞LZM和SOD活力的影響43-45
• 3.4 討論45
• 3.5 小結(jié)45-47
• 第四章 MBPs對(duì)巨噬細(xì)胞NO、iNOS及iNOS mRNA的影響47-59
• 4.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備47-48
• 4.1.1 試驗(yàn)材料47
• 4.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備47-48
• 4.2 試驗(yàn)方法48-51
• 4.2.1 巨噬細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存48
• 4.2.2 試驗(yàn)分組與處理48
• 4.2.3 蛋白質(zhì)抽提與定量48
• 4.2.4 對(duì)NO分泌的影響檢測(cè)48-49
• 4.2.5 iNOS活性的測(cè)定49-50
• 4.2.6 iNOSmRNA表達(dá)的測(cè)定50-51
• 4.3 結(jié)果與分析51-56
• 4.3.1 MBPs對(duì)NO分泌的影響51-53
• 4.3.2 MBPs對(duì)i NOS活性的影響53-54
• 4.3.3 MBPs對(duì)i NOSmRNA表達(dá)的影響54-56
• 4.4 討論56
• 4.5 小結(jié)56-59
• 第五章 結(jié)論59-61
• 5.1 結(jié)論59-60
• 5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)60
• 5.3 問(wèn)題與展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-68
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷68
• 個(gè)人情況68
• 教育背景68
• 科研經(jīng)歷68
• 在學(xué)期間發(fā)表論文68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：580822