發(fā)布時間：2017-07-26 18:34

  本文關鍵詞：分子改造提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性

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【摘要】：谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase),是一種能催化蛋白質交聯(lián)的酰胺轉移酶。由于催化活性不依賴于Ca2+,來源于鏈霉菌的TGase廣泛應用于食品、紡織、皮革及生物醫(yī)藥領域。但較低的TGase的熱穩(wěn)定性,使鏈霉菌TGase作為優(yōu)良的催化劑在工業(yè)中的應用受到嚴重的限制。本研究以來源于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13的TGase為研究對象,應用定點突變、短肽融合及兩者組合的策略提高TGase的熱穩(wěn)定性,主要研究結果如下:(1)定點突變提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性通過PoPMusic-2.1預測了降低TGase分子折疊能的氨基酸位點P132和分子結構模擬選中來源于吸水鏈霉菌的TGase基因中的W388號位點,并構建了相應的突變體。酶學分析表明,突變體P132I在50℃水浴下的半衰期達到5 min,較野生TGase提高31%;P132號位點其他的突變體較野生酶提高2-13.7%。對W388號位點的飽和突變則未能得到熱穩(wěn)定性提高的突變體。此外,P132I和P132G比酶活亦分別較野生酶提高24%和12.4%,其它突變體比酶活變化不明顯。作用力分析發(fā)現(xiàn),突變體P132I中較野生TGase增加兩個氫鍵。上述結果表明,基于蛋白質折疊自由能分析的定點突變能有效提高TGase的熱穩(wěn)定和催化活性,氫鍵的增加可能是P132I熱穩(wěn)定性提高的原因之一。(2)融合雙親短肽提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性將來源于Saccharomy cescerevisiae Zuotion蛋白的雙親短肽SAP1融合至TGase前導肽C端、成熟酶N端及C端,分別得到TGase融合酶QC-SAP1、N-SAP1和C-SAP1;將N端loop作為linker連接成熟酶的C端與雙親短肽SAP1得到融合C-L-SAP1。與野生酶相比,突變體N-SAP1在50℃下的半衰期提高78.9%,其它三個突變體則提高5-24%;各突變體比酶活下降4-30.3%。結構分析顯示,N-SAP1蛋白顆粒較野生酶顯著增大,且各突變體與野生酶的二級結構基本一致。上述結果表明,末端融合雙親短肽SAP1能有效的提高TGase的熱穩(wěn)定性,酶蛋白聚合有可能是突變體熱穩(wěn)定性提高的重要原因。(3)復合突變提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性為進一步提高TGase的熱穩(wěn)定性,將N-SAP1中的P132分別突變?yōu)楫惲涟彼帷⒏拾彼�、蛋氨酸和谷氨酰�?構建得到TGase復合突變體N-P132I、N-P132G、P132M以及P132Q。酶學分析表明,突變體N-P132I較野生TGase相比在50℃下的半衰期提高105%,其他的突變體較野生TGase提高68.4-100%。復合突變后,4個突變體的比酶活相比野生TGase下降6.5-14.5%,其中突變體N-P132I的比酶活下降了14.5%。上述結果說明,結合兩種改造策略能有效提高TGase的熱穩(wěn)定性,同時保證較高的催化活性。
【關鍵詞】：谷氨酰胺轉胺酶 熱穩(wěn)定性 折疊自由能 定點突變 雙親短肽
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-12
• 1.1 谷氨酰胺轉胺酶概述7-8
• 1.1.1 谷氨酰胺轉胺酶的催化特性、來源及活化機制7-8
• 1.1.2 谷氨酰胺轉胺酶的應用8
• 1.2 分子改造提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性8-9
• 1.2.1 鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶的結構與功能8-9
• 1.2.2 谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性改造進展9
• 1.3 酶分子熱穩(wěn)定性改造策略9-11
• 1.3.1 定點突變提高酶分子的熱穩(wěn)定性10
• 1.3.2 融合雙親短肽提高酶分子熱穩(wěn)定性10-11
• 1.3.3 酶分子熱穩(wěn)定性改造的其他策略11
• 1.4 研究意義11
• 1.5 研究內容11-12
• 第二章 材料與方法12-19
• 2.1 材料12-13
• 2.1.1 菌株與質粒12
• 2.1.2 主要試劑12
• 2.1.3 主要儀器12
• 2.1.4 培養(yǎng)基12-13
• 2.1.5 主要溶液13
• 2.2 方法13-19
• 2.2.1 分子生物學操作13-15
• 2.2.2 TGase突變體的構建15-16
• 2.2.3 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉化方法16
• 2.2.4 培養(yǎng)方法16
• 2.2.5 TGase的純化方法16-17
• 2.2.6 分析方法17-19
• 第三章 結果與討論19-33
• 3.1 定點突變提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性19-23
• 3.1.1 突變位點的確定19
• 3.1.2 突變體的表達19-20
• 3.1.3 飽和突變體熱穩(wěn)定性初篩20-21
• 3.1.4 突變體的純化及酶學性質測定21-22
• 3.1.5 突變體熱穩(wěn)定性提高機制解析22-23
• 3.2 融合雙親短肽提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性23-29
• 3.2.1 不同的位置融合雙親短肽的質粒構建23-24
• 3.2.2 突變體的表達與純化24-25
• 3.2.3 突變體酶學性質分析25-26
• 3.2.4 突變體的二級結構分析26-27
• 3.2.5 突變體N-SAP1掃描電鏡分析27
• 3.2.6 C端柔性增強對TGase酶熱穩(wěn)定性的影響27-29
• 3.3 復合突變提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩(wěn)定性29-33
• 3.3.1 復合突變位點確定29
• 3.3.2 復合突變體的表達及純化29-30
• 3.3.3 復合突變體酶學性質分析30-31
• 3.3.4 復合突變體熱穩(wěn)定性提高機制分析31-33
• 主要結論與展望33-35
• 主要結論33
• 展望33-35
• 致謝35-37
• 參考文獻37-41
• 附錄: 作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文41

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本文編號：577804