本文關(guān)鍵詞：基于衍生化技術(shù)的磷脂高效分析新方法及其應(yīng)用研究

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【摘要】：磷脂是生物體內(nèi)種類最多的一類脂質(zhì),磷脂代謝與許多不同疾病如心血管疾病等密切相關(guān),是重要的信號分子。通過了解磷脂化合物在生物體內(nèi)的代謝狀況,結(jié)合磷脂特有的生理功能,進而可全面深入地研究磷脂在生命活動過程中的作用,對脂質(zhì)組學(xué)及脂質(zhì)營養(yǎng)的研究具有重要的意義。但是PLs種類極為繁多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,因此對生物體內(nèi)復(fù)雜磷脂類化合物的分析是一項非常有挑戰(zhàn)性的工作。本課題以磷脂類化合物為研究對象,將體外化學(xué)衍生化技術(shù)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)技術(shù)相結(jié)合,開展基于化學(xué)衍生化技術(shù)的磷脂高選擇性、高靈敏定性和定量分析新方法研究,以解決現(xiàn)有質(zhì)譜技術(shù)在磷脂分析檢測中存在的技術(shù)瓶頸。本論文研究結(jié)果如下:1.建立了基于丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相對定量分析磷脂酰乙醇胺(PE)的方法。通過丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(ASID),結(jié)合DNLS-shotgun ESI-MS/MS技術(shù)使PE的分析靈敏度提高了2.2-2.5倍。通過d0-丙酮和d6-丙酮衍生化后產(chǎn)生的6Da質(zhì)量差實現(xiàn)了單個PE分子種類的相對定量分析,為解決磷脂分析中定量難的瓶頸問題提供了新思路。應(yīng)用所建方法,完成了對20%豬油高脂,20%橄欖油高脂喂養(yǎng)和正常飼料喂養(yǎng)大鼠肝臟中PE分子的定性和相對定量分析,并通過多變量分析成功的找出了差異顯著的PE分子種類。分析結(jié)果對高脂膳食引發(fā)的慢性疾病相關(guān)脂質(zhì)類生物標(biāo)志物的發(fā)掘具有指導(dǎo)意義。2.丙酮雖然常見易得,但它只能針對PE、PS等含有氨基的磷脂種類進行衍生化反應(yīng)。因此,本章又建立了一種基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂高效定性定量分析方法。一方面通過“輕”,“重”標(biāo)記后的目標(biāo)分析物按等比例混合實現(xiàn)了PLs的相對定量分析;另一方面,通過以“輕”標(biāo)記的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo),實現(xiàn)了PLs的絕對定量分析。此外,三甲基硅烷化重氮甲烷對磷脂甲基化后,PC、PE、PS、PA、PG和PI六類磷脂的檢測靈敏度分別提高了1.18-,10.21-,10.21-,14.03-,104.13-及7.28倍。通過基于混合模式固相萃取技術(shù)可快速分離血漿磷脂,結(jié)合所建立的基于甲基化和穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂高效高通量分析方法,對高血脂病人血漿中磷脂組分含量的變化進行分析。共鑒定出血漿中的33種PC,25種PE,22種PG,15種PS,17種PI和18種PA,且找出了30種具有顯著差異的磷脂分子種類。并進一步驗證了基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂相對定量和絕對定量分析方法的可行性和實用性。所建立的磷脂分析方法簡單實用,拓寬了內(nèi)標(biāo)物的選擇范圍,對脂質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)的研究都具有重要意義。3.建立了結(jié)構(gòu)磷脂的shotgun-MS分析方法。應(yīng)用該方法結(jié)合單因素實驗和響應(yīng)面實驗研究了酶法合成富含花生四烯酸結(jié)構(gòu)磷脂的工藝。得出最佳的工藝條件為:反應(yīng)溫度55.6℃,反應(yīng)時間25.1 h,酶添加量15.3%,底物摩爾比1:10.1。在此最優(yōu)條件下,ARA結(jié)合率可達15.42%,富含ARA結(jié)構(gòu)磷脂的產(chǎn)率為13.26%。并對合成產(chǎn)物中的卵磷脂(PC)分子種類進行了鑒定。該研究為富含n-6系列PUFA結(jié)構(gòu)磷脂的營養(yǎng)學(xué)特性研究及相關(guān)功能脂質(zhì)產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：磷脂 衍生化 質(zhì)譜 定性定量分析 結(jié)構(gòu)磷脂
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.63;TQ645.96
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-25
• 1.1 磷脂概述12-14
• 1.2 磷脂的分離方法14-18
• 1.2.1 薄層色譜法14
• 1.2.2 固相萃取法14-15
• 1.2.3 高效液相色譜法15-18
• 1.3 磷脂的質(zhì)譜檢測技術(shù)18-20
• 1.3.1 直接進樣質(zhì)譜技術(shù)18-19
• 1.3.2 HPLC-MS19-20
• 1.4 磷脂的定量分析方法20-21
• 1.4.1 化學(xué)衍生化技術(shù)概述20
• 1.4.2 磷脂的定量分析方法20-21
• 1.5 磷脂分析方法在脂質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用21-22
• 1.6 課題研究的目的和意義22-23
• 1.7 課題研究的內(nèi)容23-25
• 第二章 丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記相對定量分析磷脂酰乙醇胺25-38
• 2.1 實驗儀器與試劑26
• 2.1.1 實驗儀器26
• 2.1.2 實驗材料與試劑26
• 2.2 實驗方法26-28
• 2.2.1 丙酮穩(wěn)定同位素衍生PE26-27
• 2.2.2 質(zhì)譜分析方法27
• 2.2.3 定性和相對定量方法27
• 2.2.4 肝臟樣品中PE分析27-28
• 2.3 結(jié)果與討論28-37
• 2.3.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化28-30
• 2.3.2 質(zhì)譜分析靈敏度的提高30-31
• 2.3.3 相對定量方法的建立和驗證31-32
• 2.3.4 大鼠肝臟組織中PE分析32-37
• 2.4 本章小結(jié)37-38
• 第三章 基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂高效定量分析方法建立及應(yīng)用38-58
• 3.1 儀器與試劑39-40
• 3.1.1 實驗儀器39
• 3.1.2 實驗試劑39-40
• 3.2 實驗方法40-43
• 3.2.1 三甲基硅烷化重氮甲烷衍生PLs40
• 3.2.2 質(zhì)譜條件40-41
• 3.2.3 基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂相對定量分析方法建立41-42
• 3.2.4 基于甲基化和同位素標(biāo)記技術(shù)的磷脂絕對定量分析方法建立42
• 3.2.5 血漿樣本中磷脂分析42-43
• 3.3 結(jié)果與討論43-57
• 3.3.1 衍生反應(yīng)前后質(zhì)譜行為考察及質(zhì)譜條件優(yōu)化43-44
• 3.3.2 衍生反應(yīng)條件優(yōu)化44-45
• 3.3.3 檢測靈敏度的提高45-46
• 3.3.4 相對定量分析方法的建立46-47
• 3.3.5 絕對定量分析方法的建立47-49
• 3.3.6 血漿樣本中磷脂分析49-57
• 3.4 本章小結(jié)57-58
• 第四章 磷脂分析方法在酶法合成富含花生四烯酸結(jié)構(gòu)磷脂研究中的應(yīng)用58-68
• 4.1 儀器與試劑58-59
• 4.1.1 實驗儀器58-59
• 4.1.2 實驗試劑59
• 4.2 實驗方法59-61
• 4.2.1 花生四烯酸乙酯（ARA-EE）合成與純化59-60
• 4.2.2 酶法合成富含ARA的結(jié)構(gòu)磷脂60
• 4.2.3 磷脂中脂肪酸分析60
• 4.2.4 結(jié)合率和產(chǎn)率測定60
• 4.2.5 ARA結(jié)構(gòu)磷脂shogun-MS鑒定60-61
• 4.2.6 數(shù)據(jù)分析61
• 4.3 結(jié)果與討論61-67
• 4.3.1 ARA-EE合成與純化61
• 4.3.2 酶法合成ARA型磷脂的工藝條件優(yōu)化61-65
• 4.3.3 合成ARA結(jié)構(gòu)磷脂產(chǎn)物分析65-67
• 4.4 本章小結(jié)67-68
• 第五章 全文結(jié)論68-70
• 參考文獻70-78
• 致謝78-79
• 作者簡歷79
• 碩士在讀期間發(fā)表的科研論文79

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1 包正鐸;商立海;馮新斌;孟博;;同位素標(biāo)記在汞的生物地球化學(xué)研究中的應(yīng)用[J];生態(tài)學(xué)雜志;2013年05期

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1 王湘;基于衍生化技術(shù)的磷脂高效分析新方法及其應(yīng)用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

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本文編號：570185