本文關(guān)鍵詞：β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)鑒定及與木聚糖酶協(xié)同作用研究

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【摘要】：隨著世界化石能源的日益消耗,可再生能源的開發(fā)利用越來越受到人們的關(guān)注,其中生物質(zhì)能源因其來源豐富、用途廣泛,在生物科技的不斷發(fā)展進步的背景下,使用價值也在不斷增加。木質(zhì)纖維素是世界上最為豐富的生物質(zhì)資源,不僅可以轉(zhuǎn)化為能源,也可以轉(zhuǎn)化成各種化學(xué)品,生物技術(shù)在許多的轉(zhuǎn)化中扮演關(guān)鍵作用。半纖維素是木質(zhì)纖維素中的一類,含量占木質(zhì)纖維素的20%-30%。而木聚糖作為一種半纖維素,是植物中第二豐富的生物聚合物,僅次于纖維素。木聚糖最終降解成的木糖有著多種用途,例如微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。木聚糖生物降解過程需要木聚糖酶和β-木糖苷酶的參與,前者將木聚糖降解成小片段,后者則利用外切的性質(zhì)將小片段水解釋放木糖。因此,β-木糖苷酶的參與在木聚糖到木糖的生物轉(zhuǎn)化中扮演著關(guān)鍵的作用。本課題著重研究了一種β-木糖苷酶ThXylC的酶學(xué)性質(zhì)并探索了其與本課題組自有的一種木聚糖酶Xyn A協(xié)同降解木聚糖的效果。ThxylC基因來源于嗜熱厭氧桿菌Thermoanerobacterium aotearoense SCUT27,該菌是從中國境內(nèi)的一處溫泉中分離得到的。通過氨基酸序列比對可知,該酶屬于GH120家族。ThXylC經(jīng)由分子操作帶上六個組氨酸的標(biāo)簽,在E.coli BL21(DE3)中表達出來并通過鎳柱親和層析獲得純化蛋白。在酶學(xué)性質(zhì)分析中,酶活為67.00 U/mg,最適反應(yīng)溫度和pH分別為6.5和65 oC。ThXylC有著較好的溫度穩(wěn)定性,在65 oC保溫48 h之后,仍保留不低于50%的酶活。ThXylC關(guān)于終產(chǎn)物木糖的抑制常數(shù)為128 mM,保證了該酶在實際應(yīng)用中對于產(chǎn)物有著較好的耐受性。Cu~(2+)和Ni~(2+)的存在對于酶活的影響較為顯著,1 mM的Cu~(2+)和1 mM Ni~(2+)的存在使得ThXylC的酶活分別降至原酶活的24.3±4.4%和70.1±2.8%。在薄層層析的分析中,結(jié)果顯示了ThXylC對于寡聚木糖(X2-X5)的徹底降解以及ThXylC和XynA(一種木聚糖酶)對于降解木聚糖的積極作用。在與木聚糖酶協(xié)同降解甘蔗渣的實驗中,與只加入XynA的情況對比顯示了在加入XylC之后,還原糖的含量由0.233 mmol/g甘蔗渣提高到了0.366 mmol/g甘蔗渣,提升幅度為57.1%。綜合研究表明了ThXylC有著較大的工業(yè)應(yīng)用的潛力。
【關(guān)鍵詞】：嗜熱厭氧桿菌 β-木糖苷酶 酶學(xué)性質(zhì) 木聚糖酶 協(xié)同作用
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-19
• 1.1 木質(zhì)纖維素11-13
• 1.1.1 背景11-12
• 1.1.2 半纖維素與木聚糖12-13
• 1.2 木聚糖水解與 β-木糖苷酶13-16
• 1.2.1 木聚糖水解體系13-14
• 1.2.2 β-木糖苷酶的來源與分類14
• 1.2.3 糖苷水解酶催化機制研究14-15
• 1.2.4 β-木糖苷酶的熱穩(wěn)定性15-16
• 1.3 嗜熱微生物資源利用16
• 1.4 大腸桿菌異源表達概況16-17
• 1.5 論文研究內(nèi)容17-19
• 第二章 β-木糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆19-29
• 2.1 引言19
• 2.2 材料與方法19-26
• 2.2.1 菌株與載體19
• 2.2.2 主要儀器與試劑19-20
• 2.2.3 培養(yǎng)基的配制20-21
• 2.2.4 實驗方法21-26
• 2.3 結(jié)果與方法26-28
• 2.3.1 β-木糖苷酶基因的克隆與表達載體的構(gòu)建26-27
• 2.3.2 β-木糖苷酶基因ThxylC氨基酸序列分析27-28
• 2.4 本章小結(jié)28-29
• 第三章 β-木糖苷酶ThXylC的表達與純化29-38
• 3.1 引言29
• 3.2 材料與方法29-35
• 3.2.1 菌株29
• 3.2.2 主要儀器與試劑29-30
• 3.2.3 主要試劑溶液的配制30-31
• 3.2.4 實驗方法31-35
• 3.3 結(jié)果與討論35-37
• 3.3.1 ThXylC的誘導(dǎo)表達（小量表達驗證）35-36
• 3.3.2 ThXylC的純化與脫鹽36-37
• 3.4 本章小結(jié)37-38
• 第四章 β-木糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究38-48
• 4.1 引言38
• 4.2 材料與方法38-41
• 4.2.1 主要儀器與試劑38-39
• 4.2.2 實驗方法39-41
• 4.3 結(jié)果與討論41-46
• 4.3.1 ThXylC最適反應(yīng)pH與溫度的研究41
• 4.3.2 ThXylC熱穩(wěn)定性的研究41-42
• 4.3.3 ThXylC動力學(xué)參數(shù)的測定42-43
• 4.3.4 ThXylC底物特異性的測定43
• 4.3.5 金屬離子、EDTA和糖對ThXylC的抑制研究43-46
• 4.4 本章小結(jié)46-48
• 第五章 重組 β-木糖苷酶ThXylC的協(xié)同水解作用48-57
• 5.1 引言48
• 5.2 材料與方法48-51
• 5.2.1 主要儀器與試劑48-49
• 5.2.2 實驗方法49-51
• 5.3 結(jié)果與討論51-56
• 5.3.1 重組木聚糖酶XynA的表達與純化51-52
• 5.3.2 重組 β-木糖苷酶ThXylC的水解模式的鑒定52-54
• 5.3.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立54
• 5.3.4 ThXylC與木聚糖酶和纖維素酶協(xié)同水解甘蔗渣54-56
• 5.4 本章小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-59
• 參考文獻59-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果63-64
• 致謝64-65
• 附件65

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3 李U，

本文編號：568366