無膜細(xì)胞器是細(xì)胞內(nèi)具有液體性質(zhì)的蛋白質(zhì)和核酸的聚集體。這些亞細(xì)胞內(nèi)區(qū)室是蛋白或者核酸通過液-液相分離的方式聚集在一起形成的。蛋白相分離參與了細(xì)胞眾多重要的生理過程而受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),相分離涉及到的細(xì)胞內(nèi)活動有無膜細(xì)胞器的形成、超分子組裝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因激活、細(xì)胞骨架等。另外,相分離現(xiàn)象與某些疾病如神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前關(guān)于相分離現(xiàn)象的研究方法主要集中在分子生物學(xué)、體外重組和顯微成像技術(shù)等,利用核磁共振方法研究蛋白質(zhì)相分離的報道還比較少。有文獻(xiàn)報道,ATP依賴的RNA解旋酶DDX4可以在體外和細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相分離形成小液滴,并且溫度和鹽濃度等外界條件可以調(diào)控DDX4的相分離。DDX4由236個氨基酸殘基組成的無序N末端(DDX4N1)可以在溶液中發(fā)生相分離形成直徑微米級別的小液滴,并且這些小液滴可以行使“過濾器”或者“濃縮器”的功能,選擇性地招募某些生物大分子到這些小液滴中。研究發(fā)現(xiàn),DDX4N1相分離時可以招募單鏈的核酸,并且使單鏈的核酸穩(wěn)定,但是排斥雙鏈的核酸;對蛋白質(zhì)而言,這些小液滴呈現(xiàn)出范圍很廣的吸收或者排斥能力,并且那些能夠被招募的蛋白能夠充當(dāng)載體運輸不能進(jìn)入的...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 蛋白質(zhì)的液-液相分離
        1.1.1 細(xì)胞內(nèi)的無膜細(xì)胞器
        1.1.2 細(xì)胞內(nèi)相分離的重要性
        1.1.3 相分離機(jī)制的研究
        1.1.4 DDX4的相分離研究
        1.1.5 核磁共振方法在相分離研究中的應(yīng)用
    1.2 核磁共振波譜學(xué)
        1.2.1 核磁共振的基本原理
        1.2.2 核磁共振的檢測參數(shù)
        1.2.3 ¹⁹F NMR
        1.2.4 ¹H-¹⁵N HSQC
        1.2.5 NOESY實驗和EXSY(化學(xué)交換)實驗
        1.2.6 T1、T2的測定
    1.3 小結(jié)
2 DDX4N1和SH3的表達(dá)與純化
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 DDX4N1和SH3表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 DDX4N1與SH3的表達(dá)
        2.2.4 DDX4N1與SH3的純化
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 DDX4N1表達(dá)情況分析
        2.3.2 DDX4N1第一次Ni柱親和層析結(jié)果
        2.3.3 脫鹽柱層析置換酶切Buffer結(jié)果
        2.3.4 酶切和第二次Ni柱親和層析結(jié)果
        2.3.5 脫鹽柱層析結(jié)果
        2.3.6 SH3過QFF離子交換層析結(jié)果
        2.3.7 SH3凝膠過濾層析結(jié)果
        2.3.8 SH3脫鹽柱層析結(jié)果
    2.4 小結(jié)
3 DDX4N1相分離及其結(jié)構(gòu)的研究
    3.1 前言
    3.2 實驗與方法
        3.2.1 DDX4N1的表達(dá)與純化
        3.2.2 DDX4N1相分離條件的摸索
        3.2.3 DDX4N1的相分離效率
        3.2.4 DDX4N1的核磁共振實驗
        3.2.5 DDX4N1圓二色譜(CD)實驗
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 DDX4N1的最佳相分離條件及其相分離效率
        3.3.2 DDX4N1相分離結(jié)構(gòu)的改變
    3.4 小結(jié)
4 DDX4N1相分離時包裹SH3和G-四鏈體的研究
    4.1 前言
    4.2 實驗與方法
        4.2.1 蛋白樣品的制備
        4.2.2 G-四鏈體的準(zhǔn)備
        4.2.3 FITC標(biāo)記SH3和DDX4N1
        4.2.4 DDX4N1相分離形成的droplets包裹SH3與G-四鏈體的觀察
        4.2.5 SH3和G-四鏈體對DDX4N1相分離作用觀察
        4.2.6 DDX4N1相分離形成的droplets包裹SH3濃度的測定
        4.2.7 DDX4N1相分離形成的droplets包裹SH3核磁樣品的制備
        4.2.8 SH3在Ficoll 70溶液中核磁樣品的制備
        4.2.9 核磁共振實驗
        4.2.10 SH3熱力學(xué)參數(shù)的擬合
    4.3 結(jié)果討論
        4.3.1 DDX4N1相分離包裹SH3和G-四鏈體的觀察
        4.3.2 SH3和G-四鏈體對DDX4N1相分離的作用
        4.3.3 SH3在DDX4N1相分離形成的droplet中濃度的測定
        4.3.4 DDX4N1與SH3和G-四鏈體的相互作用
        4.3.5 DDX4N1相分離時液液相包裹SH3
        4.3.6 SH3在DDX4N1 condensate中的動力學(xué)參數(shù)
    4.4 小結(jié)
5 總結(jié)和展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介及攻讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)成果



本文編號：3962730